2. 中国农业大学生物学院, 北京 100193
2. College of Biological Science, China Agricultural University, Beijing 100193, China
附植前胚胎的发育及调控机制的解析、胚胎干细胞的分离及体外培养体系的优化，可以为人类生殖临床医学和家畜繁殖育种等提供理论依据。受精卵经过卵裂和早期分化，到囊胚阶段已经含有原始外胚层细胞、原始内胚层和胚外滋养层3种类型细胞[1-2]。目前，仅从小鼠囊胚的3种类型细胞建立了干细胞系，分别是胚胎干细胞系(ES细胞)，滋养层干细胞系(TS细胞)，胚外内胚层干细胞系(XEN细胞)[3-6]。不同干细胞系进行囊胚注射，都表现为限制性分化并嵌合到它们母源细胞可以衍生的胚层组织，如XEN细胞系进行囊胚注射主要参与原始内胚层脏层的分化[6]。此外，胚层的分化与转分化受到关键转录因子的调控，研究发现在ES细胞系中抑制Oct3/4的表达或上调Cdx2可以获得TS细胞系[7]。D.Shimosato等[8]报道小鼠的ES细胞中过表达Gata4或Gata6可以将ES细胞诱导分化为胚外内胚层干细胞系。
Gata6在猪早期囊胚中仅在内细胞团表达，表达模式与Oct4相似，预示其在诱导多能干细胞过程中具有重要作用。Gata6是进化保守的Gata转录因子家族的成员，其含有两个锌指结构，Gata家族包括6个分子，其中Gata6主要表达于中胚层和内胚层来源的组织，如心、消化道上皮、肝和肺等，因其能结合特定的核苷酸序列(A/T)GATA(A/T)而得名[9-10]。Gata6在胚胎发育过程中主要参与细胞增殖和分化的调控，敲除Gata6小鼠，在E6.5 d死亡且伴随内胚层脏层(Visceral endoderm)分化缺陷[11-16]。在小鼠的早期囊胚中，Gata6主要在原始内胚层(Primitive endoderm)表达。在人和小鼠体细胞重编程过程中，Gata6可以代替Oct4，与Sox2、Klf4和mMyc促使重编程的发生，获得人和小鼠的iPSCs[17]。这说明Gata6在干细胞多能性建立上存在一定的作用。根据本实验室猪附殖前胚胎转录组分析发现，Gata6仅在猪早期囊胚的内细胞团细胞中表达，Gata6的表达模式与Oct4很相似[18]。Gata6在猪诱导多能干细胞分离中可能具有重要作用。
利用OSKM 4因子(Oct4、Sox2、Klf4和mMyc)结合其他因子已经获得了猪iPS细胞，这些细胞虽然具有多能干细胞的特征，如体外向三胚层的分化、表达特定干细胞标记、形成畸胎瘤等，但到目前为止，猪iPS细胞还未能获得高生殖系嵌合体，而且其干细胞特征的维持需要外源基因的持续表达[19-22]。这与猪还没有真正的ES细胞系和优化的体外培养体系有关。另外，在猪上也没有分离获得TS细胞和XEN细胞系，这可能与不同物种的不同调控机制有关，本实验室在猪附植前不同阶段胚胎转录组分析结果也证明这一点[18, 23]。基于此，本试验对猪囊胚内细胞团特异表达的Gata6在诱导多能干细胞重编程过程中的作用进行了深入研究。
1 材料与方法 1.1 试验动物CD-1小鼠、免疫缺陷小鼠(BALB/c Nude Mouse)购于北京维通利华实验动物技术公司。
1.2 细胞系病毒包装细胞系GP2-293购于ATCC；猪胎儿心肌细胞、猪胎儿成纤维细胞系(取自于农大小香猪26日龄的胎儿)为本实验室分离。
1.3 质粒逆转录病毒质粒pMXs-pOct4、pMXs-pSox2、pMXs-pKlf4、pMXs-Myc、pMXs-Gata6、pMXs-Lin28、pMXs-Tbx3以及pMXs-Nanog均由本实验室构建，病毒包装质粒V-SVG购自Addgene。
培养基各成分无特殊说明均购自Gibco。成纤维细胞培养基(MEF培养基)：10% FBS、1% Glutamine-Max和1%双抗(Invitrigen公司)。
猪iPS细胞培养基：1% Glutamine-Max、1%丙酮酸钠、1%非必需氨基酸、1%双抗、42% DMEM/F12和42% Neurobasal Medium(Invitrigen公司)，1% N2、1% B27、0.1% LIF (1 000×)(Millipore)，0.1% CHIR99021、0.1% PD0325901(Selleck公司)。
XEN细胞培养基：RPMI 1640含20% FBS (CanSera, Rexdale, Canada)，1 mmol·L-1丙酮酸钠、2 mmol·L-1 L-谷氨酰胺、50 mg·mL-1双抗、10 μmol·L-1β-巯基乙醇、25 ng·mL-1重组人FGF4和1 μg·mL-1肝素(Sigma)。
1.4 猪诱导多能干细胞制备猪诱导多能干细胞的诱导主要参考K.Takahashi等[25]建立的方法：(1)病毒感染的前1天准备猪胎儿成纤维细胞，6孔板中的一个孔中铺上1×105个细胞。(2)第2天观察细胞贴壁和生长状况, 细胞分布均匀和状态良好为宜。(3)将装浓缩病毒液的1.5 mL离心管, 4 ℃ 10 000×g离心5 min。除去血清中的蛋白沉淀。(4) Oct4、Sox2、Klf4和mMyc因子病毒体积按照1:1:1:1的比例加入孔中, 再加入1 mL新鲜培养基。最后加入凝聚胺(终浓度达到8 μg·mL-1), 混合均匀。(5) 12 h后, 弃去含有病毒的培养基, 换成新鲜MEF培养基, 这天计为0 d。(6)准备饲养层细胞。在感染后2~3 d, 准备4~6个6孔板, 明胶包被后, 铺上饲养层细胞。(7)消化感染后的猪成纤维细胞, 并用细胞计数仪计数。在6孔板的每个孔中铺上2×104个细胞。每个孔中加入2 mL培养基。然后左右前后轻轻地晃动, 使细胞分布均匀, 放入CO2培养箱内培养。(8)第2天换成iPSCs诱导培养基, 开始诱导。隔2 d换1次培养基。(9)每天观察细胞生长状况, 3~4 d可以出现明显的细胞增殖和细胞形变, 7~14 d内出现克隆。
1.5 重编程效率及XEN细胞样细胞标记检测染色的过程完全按照Sigma公司的Leukocyte Alkaline Phosphatase Kit进行碱性磷酸盐(AP)染色。
有克隆的培养皿用PBS洗涤3遍，4%多聚甲醛固定15 min之后，PBS洗涤，0.5% TritonX-100通透膜10 min，PBS洗涤，1% BSA封闭30 min，加一抗过夜，加二抗2 h，荧光显微镜下观察，免疫荧光染色。
1.6 数据分析每组试验至少3次生物学重复和3次技术重复，数据均用“平均值±标准误(Mean±SD)”表示。组间比较用t检验进行差异显著性分析。P < 0.05表示差异显著，P < 0.01和P < 0.001表示差异极显著。
2 结果 2.1 Gata6促进重编程效率，G6SKM进行重编程Gata6与Oct4、Sox2、Klf4和mMyc(OSKM)结合(G6OSKM)感染猪胎儿成纤维细胞后，在第10天检测碱性磷酸酶(AP)的阳性的细胞克隆数，发现其阳性率显著高于OSKM对照组(P < 0.01，图 1)。利用流式细胞分析仪检测早期多能性干细胞标记SSEA-1，结果显示含Gata6组的SSEA-1阳性表达比例高于对照组。用Gata6代替Oct4后(G6SKM)，可以进行重编程，获得AP阳性克隆，但AP阳性克隆数目显著低于OSKM对照组(P < 0.05)，同时，SSEA-1的表达比例也低于OSKM对照组(图 2)。
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A.AP染色(比例尺：1 cm)；B.AP阳性克隆数的统计；C.流式分析SSEA-1的表达比例。**.P < 0.01。下同 A. AP staining (The scale bar: 1 cm); B.The number of AP positive clones; C.Flow cytometry analysis of the expression ratio of SSEA-1. **.P < 0.01. The same as below 图 1 Gata6与OSKM结合促进早期重编程 Figure 1 Combination of Gata6 with OSKM promotes early reprogramming |
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A.AP染色(比例尺：1 cm)；B.AP阳性克隆数的统计；C.流式分析SSEA-1的表达比例(以猪成纤维细胞PEF为对照)，*.P < 0.05。下同 A. AP staining (The scale bar: 1 cm); B.The number of AP positive clones; C.Flow cytometry analysis of the expression ratio of SSEA-1 (using pig fibroblast PEF as control), *.P < 0.05. The same as below 图 2 G6SKM进行重编程细胞黏连程度 Figure 2 G6SKM in reprogramming cell adhesion degree |
Gata6在重编程后期(第10天后)，与对照组(OSKM组)相比，Gata6参与重编程的iPS细胞都发生了分化，细胞克隆变得更加松散，细胞形态逐渐成为菱形多边形为主，类似小鼠XEN细胞形态。q-PCR检测发现无论是G6SKM还是G6OSKM组，内源性Sox2的表达都发生了下调(图 3)。将分化的G6SKM以及G6OSKM细胞使用小鼠XEN细胞培养基培养可以获得XEN细胞状态的细胞，细胞形态呈现圆形或者多边形。免疫荧光染色显示G6SKM与G6OSKM获得XEN细胞样细胞都表达XEN细胞特异标记分子：Gata6、Gata4和Sox17(图 4)。这说明Gata6促进猪XEN细胞样细胞的分离和体外增殖。
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A.OSKM组、G6OSKM组和G6SKM组细胞的形态，右侧图片为左侧图中方框部分的放大(比例尺：100 μm)；B、D.内源性Oct4的表达; C、E.内源性Sox2的表达。***.P < 0.001。下同 A.The morphology of cells in group OSKM, group G6OSKM and group G6SKM, the right pictures are the enlargement of the boxes in the left chart (The scale bar: 100 μm); B, D. The endogenous expression of Oct4; C, E.The endogenous expression of Sox2. ***. P < 0.001. The same as bolow 图 3 Gata6在重编程后期促进iPS细胞克隆向XEN细胞样细胞分化 Figure 3 Gata6 induces differention of XEN cell like cells during late reprogramming |
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A. G6SKM细胞; B.G6OSKM细胞; C. G6SKM免疫荧光染色; D.G6OSKM免疫荧光染色 A. G6SKM cell; B. G6OSKM cell; C.G6SKM immunofluorescence staining; D. G6OSKM immunofluorescence staining 图 4 XEN细胞样细胞形态与免疫染色(比例尺：100 μm) Figure 4 XEN cell like cells morphology and immunostaining (The scale bar:100 μm) |
将Gata6与多能性重编程因子(OSKM以及Lin28、Tbx3、Nanog)组合一起感染猪成纤维细胞，可以更有效地获得XEN细胞样细胞。多因子获得的XEN细胞样细胞在形态上更加接近于小鼠的XEN细胞，见图 5。
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A.诱导XEN细胞样细胞的过程；B.多因子诱导XEN细胞样细胞：a.10 d分化的克隆; b.第1次传代后的细胞; c和d.稳定传代后的细胞；C.免疫荧光染色 A.The process of inducing XEN cell-like; B. The morphology of XEN cell-like induced by multiple factors: a.10 d cloning of differentiation; b.morphology of cells after the first passage; c and d. Morphology of stable passaged cells; C.Immunofluorescence staining 图 5 Gata6与多因子结合诱导XEN细胞样细胞(比例尺:100 μm) Figure 5 Iduction of XEN cell like cells by combination of Gata6 with multi factors (The scale bar: 100 μm) |
小鼠胚胎干细胞过表达Gata6和Gata4可以获得XEN细胞。利用Gata6逆转录病毒表达载体在猪iPS细胞过表达Gata6后，发现细胞逐渐变成圆形、菱形或者是多边形的形态，形态类似XEN细胞。q-PCR检测发现，猪iPS细胞过表达Gata6后，内源性多能性基因Oct4、Sox2、Klf4、Nanog以及Rex1都出现下调。免疫荧光染色显示这些XEN细胞样细胞Gata6、Gata4以及Sox17呈阳性。同时，q-PCR检测显示XEN细胞特异标记[24]，如Dab2、Gata4、Sox17和Pdagfra都出现极显著上调(P < 0.001，图 6)。
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A.piPSCs过表达Gata6(Gata6 OE)后细胞，Control.对照组(比例尺：100 μm)；B.q-PCR检测显示Gata6在猪iPS细胞出现显著上调；C. q-PCR显示, Gata6过表达后多能性基因在猪iPS细胞出现下调; D.免疫荧光染色显示Gata6、Gata4以及Sox17呈现阳性(比例尺:100 μm)；E.q-PCR检测XEN细胞表达特异基因Dab2、Gata4、Sox17以及Pdagfra A.The morphology of cells after overexpression of Gata6 (Gata6 OE) in piPSCs, (Control is control group) (The scale bar: 100 μm); B.q-PCR assay showed that Gata6 significantly up-regulated in piPSCs; C. q-PCR display pluripotency genes decreased after overexpress Gata6 in the piPSCs; D. Immunofluorescence staining showed that Gata6, Gata4 and Sox17 were positive (The scale bar: 100 μm); E.q-PCR detection XEN cell marker Dab2, Gata4, Sox17 and Pdagfra expression 图 6 猪iPS细胞过表达 Gata6 Figure 6 Overexpression of Gata6 in pig iPS cells (piPSCs) |
小鼠成纤维细胞过表达4个转录因子Oct4、Sox2、Klf4和mMyc，可将体细胞诱导为多能干细胞，称为诱导多能干细胞(iPS细胞)[25]。iPSCs与胚胎干细胞(ES细胞)特征相似，具有多潜能性，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞，如神经细胞、血液细胞、心肌细胞等[26]。最重要的是它符合干细胞的标准，可以形成四倍体补偿小鼠[27-28]。iPS细胞具有诸多优点：首先来源方便，丰富；且不会引起免疫排斥，成为个性化医疗的工具；不需要以胚胎为代价，克服了传统ESCs分离所涉及的伦理问题[29]。因此，诱导多能干细胞研究具有更广阔的应用前景。J.Shu等[17]发现，利用小分子化合物诱导iPSCs的过程中会产生非常特殊的胚外内胚层干细胞(XEN)样阶段。小鼠胚胎干细胞过表达Gata6和Gata4可以获得XEN细胞[17, 30]。因此，本试验对Gata6在猪的诱导多能干细胞中的作用进行了系统研究。
研究发现，Gata6与经典4因子OSKM结合感染猪胎儿成纤维细胞后，在第10天检测碱性磷酸酶(AP)的阳性细胞克隆数，发现其阳性率显著高于对对照组。流式分析检测早期多能性标记SSEA-1，发现Gata6组的SSEA-1表达比例高于对照组。这说明Gata6可以促进4因子的早期重编程过程。而Gata6代替Oct4后，AP阳性克隆数目低于对照组，SSEA-1的表达比例也低于对照组，这说明Gata6代替Oct4后的重编程效率低于Oct4。
Gata6在重编程第10天之后，与对照组OSKM组相比，Gata6参与的重编程都发生了分化，细胞克隆变得更加松散，细胞形态逐渐成为XEN细胞形态，菱形多边形为主。q-PCR检测发现G6SKM和G6OSKM组，内源性多能基因Sox2的表达都发生了下调，这可能是导致分化的原因之一。将分化的G6SKM以及G6OSKM细胞用小鼠XEN细胞培养基培养可以获得XEN细胞样细胞。细胞形态呈现圆形或者多边形，免疫荧光染色显示G6SKM与G6OSKM组细胞都表达XEN细胞特异标记：Gata6、Gata4和Sox17。多能性基因Sox2表达下调，XEN细胞样细胞表面抗原Gata6、Gata4和Sox17免疫染色结果呈阳性。这些结果表明, Gata6在重编程过程中，促进重编程细胞向XEN细胞分化。为了进一步提高XEN细胞样细胞的分离和培养，将Gata6与OSKM、Lin28、Tbx3以及Nanog组合一起感染猪成纤维细胞，可以有效获得XEN细胞样细胞，多因子获得的XEN细胞样细胞在形态上更加接近于小鼠的XEN细胞。综上表明，Gata6结合多能性重编程因子，可直接将猪成纤维细胞重编程为XEN细胞样细胞。
小鼠胚胎干细胞过表达Gata6和Gata4可以获得XEN细胞，具有相应的生物学特征，表达特异的细胞标记。对猪成纤维细胞重编程的XEN细胞样细胞进行生物学检测，发现内源多能性基因Oct4、Sox2、Klf4、Nanog以及Rex1都出现下调，同时，定量PCR检测显示XEN细胞标记基因如Dab2、Gata4、Sox17和Pdagfra都出现上调，而且Gata6、Gata4和Sox17免疫学染色呈阳性。结果说明这些细胞具有XEN细胞生物学特性。
4 结论在猪成纤维细胞重编程过程的早期，Gata6可以促进重编程效率，后期Gata6促进重编程细胞向类XEN细胞分化；猪iPS细胞过表达Gata6，向类XEN细胞分化，可以获得XEN细胞样细胞；将Gata6与OSKM、Lin28、Tbx3以及Nanog组合一起转染猪成纤维细胞，可以有效获得XEN细胞样细胞。
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