畜牧兽医学报  2017, Vol. 48 Issue (12): 2301-2313. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2017.12.010    PDF    
基于转录组数据的蒙古牛皮肤组织抗寒相关信号通路及候选基因的筛选
齐昱, 邢燕平, 潘静, 凌宇, 曹宇, 周欢敏     
内蒙古农业大学生命科学学院, 呼和浩特 010019
摘要:本研究旨在通过对冬夏两季蒙古牛皮肤组织进行转录组测序和生物信息学分析,找到与蒙古牛抗寒性状相关的信号通路及候选基因。用Ion ProtonTM Sequencer分别对冬季和夏季成年蒙古牛的皮肤组织进行转录组测序,随后对转录组数据进行处理、与参考基因组比对、差异表达分析、GO和KEGG富集分析以及候选基因筛选,并用Real-time PCR方法对转录组数据进行可靠性检测。结果显示,冬季组和夏季组分别得到86 954 060和69 837 009条reads;冬季组与参考基因组的唯一比对率为73.21%,夏季组为75.55%;冬夏两组共有182个差异表达基因(DEGs),与夏季组相比,其中117个在冬季组中上调,65个在冬季组中下调;Real-time PCR分析显示,转录组测序结果可靠;GO分析结果显示,细胞组分、分子功能、生物学过程分别富集到21、39和224个term;KEGG分析结果显示,差异表达基因(DEGs)显著地富集在脂类代谢、凝血、酪氨酸代谢、类固醇合成和视黄醇代谢相关通路上;共筛选出8个候选基因。综上表明,脂类代谢、凝血、黑色素合成相关通路和基因,以及与毛发发生相关的基因可能在蒙古牛抗寒过程中发挥重要作用。
关键词蒙古牛    皮肤组织    转录组    信号通路    差异表达基因    
Screening of Cold Tolerance-Related Signaling Pathways and Candidate Genes in Mongolia Cattle Skin Tissues Based on Transcriptome Data
QI Yu, XING Yan-ping, PAN Jing, LING Yu, CAO Yu, ZHOU Huan-min     
College of Life Sciences, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China
Abstract: The aim of this study was to find out signaling pathways and candidate genes that related to cold tolerance of Mongolia cattle by RNA-sequencing and bioinformatics analysis of Mongolia cattle skin tissues in winter and summer. Transcriptome sequencing skin tissues of adult Mongolia cattle in winter and summer were carried out by Ion ProtonTM Sequencer, respectively. And then data processing, reference genome alignment, gene differential expression analysis, GO and KEGG enrichment analysis and candidate gene screening were applied on the transcriptome data; Additionally, the reliability of the transcriptome data was detected by Real-time PCR. The results showed that 86 954 060 and 69 837 009 reads were obtained from winter and summer groups, respectively; The percentage of the uniquely mapped reads was 73.21% in winter group, and 75.55% in summer group. There were 182 DEGs between winter and summer groups, compared to summer group, 117 were up-regulated and 65 were down-regulated in winter group; Real-time PCR analysis showed that the transcriptome sequencing results were reliable; The results of GO analysis showed there were 21, 39 and 224 terms enriched in the cellular components, molecular functions and biological processes, respectively; KEGG analysis showed that the DEGs were significantly enriched in lipid metabolism, blood coagulation, tyrosine metabolism, steroid hormone biosynthesis and retinol metabolism related pathways; 8 candidate genes were screened out. In summary, lipid metabolism, blood coagulation and melanin synthesis related pathways and genes as well as hair synthesis related genes may play an important role in cold resistance of Mongolian cattle.
Key words: Mongolia cattle     skin tissue     transcriptome     signal pathway     differentially expressed genes    

蒙古牛属于哺乳纲(Mammalia),偶蹄目(Artiodactyla),牛科(Bovidae),牛属(Bos taurus),原产于蒙古高原地区,目前广泛分布于蒙古国、俄罗斯,中国内蒙古、东北、华北北部和西北地区。蒙古高原地处内陆,气候具有强烈的大陆性特征,局部地区冬季最低温度可达-40 ℃以下甚至-50 ℃。在蒙古高原极为寒冷的冬季,蒙古牛能够正常地生存、生产,表现出较高的生产性能和遗传稳定性。在长期自然选择和人工选择的条件下,蒙古牛逐渐形成了抗寒、抗旱、抗病、耐粗饲等特点,这些特点及优势使其成为蒙古高原的优势畜种之一。

目前对于哺乳动物抗寒机制的研究主要集中于小型哺乳动物和人类当中,他们的冷适应性产热主要依赖于褐色脂肪(BAT)、米色脂肪(Brite)这两种产热性脂肪[1-4],BAT和Brite中表达解偶联蛋白1(UCP1),该蛋白位于细胞线粒体内膜上,可以将线粒体内膜上的呼吸链与氧化磷酸化解耦连,使呼吸链传递质子形成的膜内外质子动势不再用于ATP的产生,而被用于产生热量[5]。但大型哺乳动物只在初生时存在产热性脂肪,随着年龄增长产热性脂肪逐渐退化,成体大型哺乳动物尚无存在BAT的报道[6-7],对成体大型哺乳动物抗寒机制的研究尚存在较大空白。

皮肤是哺乳动物最大的器官也是与外界接触最直接的器官,它的主要功能是保护身体、排汗、感受冷热和压力。机体通过皮肤上的温度感受器来感知外周环境温度的改变,皮肤对温度的感知可以为机体维持体温提供调节性输入信号[8-9]。而且哺乳动物皮肤上分布有大量的毛囊及汗腺[10],它们在维持和调节哺乳动物体温方面发挥重要作用。转录组广义上指在特定状态下组织或细胞内转录出来的所有RNA的集合,包括mRNA和非编码RNA如rRNA、ncRNA、sRNA、tRNA等,狭义上的转录组专指所有mRNA的集合[11]。目前针对动物皮肤组织的转录组学研究已广泛而深入地展开,研究对象遍及鱼类[12]、两栖类[13]、鸟类[14]和哺乳类[15-17]中的多个群体和物种。

虽然蒙古牛的性状如此独特和优良,但截止目前对其遗传学及抗寒机制的研究几乎为空白。本研究对冬夏两季蒙古牛皮肤组织进行高通量转录组测序和生物信息学分析,为进一步了解蒙古牛的抗寒机制和为分子育种奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料和试剂 1.1.1 试验动物与组织样品采集

以冬夏两季蒙古牛为研究对象,分别选取冬季(12月份)10岁公牛、8岁母牛和3岁公牛各1头以及夏季(8月份)4岁公牛、6岁公牛和9岁母牛各1头,分别进行编号。以上试验动物均无血缘关系,由蒙古国农业部提供,冬季组采集温度为-35~-42 ℃,夏季组采集温度为26~30 ℃。分别将各试验动物的背部皮肤上的毛剃掉一部分,将动物宰杀后迅速切取各试验动物剃毛部位的皮肤,并用液氮速冻后,-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 仪器与试剂

Ion ProtonTM Sequencer,Ion OneTouch 2 Instrument,Ion OneTouch ES,LightCycler480实时定量PCR仪等仪器均由本实验室(内蒙古农业大学生物制造重点实验室)提供。动物组织RNA提取试剂盒Rneasy MiNi Kit购于QIAgen公司;总RNA质控试剂盒及cDNA文库质控试剂盒Agilent RNA nano Assay,Agilent RNA6000 Pico Assay和Agilent High Sensitivity DNA Kit等均购自Agilent公司;mRNA纯化所需试剂盒Dynabeads® mRNA DIRECTTM Micro Kit,cDNA文库构建所需试剂盒Ion Total RNA-Seq Kit v2.0、Ion PITM Controls Kit V2、Dynabeads® MyOneTM Streptavidin C1 Magnetic,模板制备所需试剂盒Ion PITM Template OT2 200 Kit V2和测序所需试剂盒Ion PITM Sequencing 200 Kit V2、Ion PI Chip Kit v2、Ion Xpress RNA-Seq Barcode、ERCC ExFold RNA Spike-In Mixes均购自Thermo Fisher Scientific公司;实时定量PCR所需试剂PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法 1.2.1 总RNA提取、RNA完整度检测与mRNA纯化

将各试验动物的皮肤组织在液氮中分别进行研磨后,按照Rneasy Mini Kit说明书所述的方法分别提取总RNA。用Agilent 2100生物分析仪检测各组总RNA的浓度和完整度,总RNA含量>10 μg,完整度(RIN值)>7.0为合格,用于下一步试验。用Dynabeads® mRNA DIRECTTM Micro Kit对mRNA进行纯化,步骤详见说明书。

1.2.2 文库构建与模板制备

分别对3组冬季蒙古牛皮肤组织总RNA和3组夏季蒙古牛皮肤组织总RNA进行混合建库,冬季组编号W-skin,夏季组编号S-skin。文库构建步骤详见Ion Total RNA-Seq Kit v2说明书,模板制备步骤详见Ion PITM Template OT2 200 Kit v2说明书。

1.2.3 测序与数据处理

对制备好的模板进行测序,步骤详见Ion PITM Sequencing 200 Kit v2说明书。使用Perl脚本去掉原始数据的测序接头,短序列( < 30 bp)和低质量reads。

1.2.4 与参考基因组的比对

用STAR[18](https://github.com/alexdobin/STAR/archive/STAR_2.5.2 a.tar.gz)和Bowtie2[19](https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/)将处理后的高质量reads与参考基因组进行比对,获得各样品reads的比对效率和reads在基因组上的位置信息。参考基因组来源于Ensembl,序列为Bos taurus的UMD 3.1版本,基因组注释版本为Version 81(http://www.ensembl.org/Bos_taurus/Info/Index/)。用RseQC[20]软件包统计reads在基因组不同特征中的分布情况。

1.2.5 基因定量及差异表达分析

采用edgeR[21]软件包对差异表达基因进行检测,并根据|log2(FC)|≥2, FDR≤0.05的过滤标准进行筛选。

1.2.6 差异表达基因的GO分类与富集分析

用DAVID在线软件对冬夏两季蒙古牛皮肤组织差异表达基因(Differentially expressed genes, DEGs)进行GO注释,按照细胞组分(Cellular component)、分子功能(Molecular Function)、生物学过程(Biological process)对其进行分类。

1.2.7 差异表达基因的KEGG富集分析

用DAVID在线软件对冬夏两季蒙古牛皮肤组织DEGs作KEGG代谢通路分析。

1.2.8 测序结果可靠性分析

在冬夏两季蒙古牛皮肤组织DEGs中随机地选择8个,其中4个在W-skin中上调,4个在W-skin中下调。以β-actin(ACTB)为内参基因进行实时定量PCR(Real -time PCR)。在罗氏网站(https://lifescience.roche.com)上设计上述8个DEGs和β-actin的特异性引物并交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应体系见SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ说明书,反应条件:95 ℃5 s;95 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,40个循环;60 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s;40 ℃ 10 s。引物序列见表 1。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

表 1 实时定量PCR引物 Table 1 Primers of Real-time quantitative PCR
2 结果 2.1 冬夏两季蒙古牛皮肤组织总RNA质量检测

Agilent RNA nano Assay和Agilent 2100生物分析仪的质控分析结果显示,冬夏两季蒙古牛共计6个皮肤组织样本的总RNA总量均≥10 μg,完整度(RIN值)均≥7。

2.2 冬夏两季蒙古牛皮肤组织cDNA文库质量检测

冬夏两季蒙古牛皮肤组织cDNA文库质控结果显示,W-skin cDNA文库的片段大小为168~310 bp,S-skin cDNA文库的片段大小为168~298 bp。两文库片段大小均为150~450 bp,长度合格,文库构建成功。

2.3 冬夏两季蒙古牛皮肤组织cDNA测序质量评估

对冬夏两季蒙古牛的cDNA文库进行测序,共测得2张芯片,2张芯片的ISP loading率均>75%,Key Signal均>50,测序平均长度均>80 bp,测序结果合格。

2.4 冬夏两季蒙古牛皮肤组织碱基数和基因组比对 2.4.1 碱基数数据统计

W-skin测得86 954 060条reads,总碱基数为8 054 832 969 bp,平均读长为91 bp,平均GC含量为47.66%;S-skin测得69 837 009条reads,总碱基数为6 513 545 916 bp,平均读长为93 bp,平均GC含量为46.91%(表 2)。

表 2 样本数据产出统计 Table 2 The statistical of each sample output data
2.4.2 Reads数据分析

将原始reads进行分类,分别统计W-skin和S-skin中短reads、含接头序列reads、含poly(A)reads、含poly(T)reads以及高质量reads等的数目。经Perl脚本过滤处理后W-skin共得到高质量(HQ)reads 80 893 856条,占总reads数的93.03%;夏季蒙古牛皮肤组织S-skin共得到HQ reads 64 728 203条,占总reads数的92.68%,各类别所占比例与具体reads数目详见表 3

表 3 原始reads分类 Table 3 Classification of raw reads
2.4.3 与基因组比对结果

比对结果显示,W-skin与参考基因组的比对率为97.96 %,唯一比对率为73.21%;S-skin与参考基因组的比对率为99.19%,唯一比对率为75.55%。各类别所占比例与具体reads数目详见表 4

表 4 基因组比对统计 Table 4 The statistical list of mapping to genome
2.5 基因定量及差异表达分析

W-skin和S-skin之间的DEGs共有182个。与S-skin相比,在W-skin中上调的基因共有个117,下调的基因共有65个。W-skin和S-skin基因差异性表达的火山图见图 1,图中X轴为log2(FC),FC表示基因表达量差异倍数(Fold change)。Y轴为-lg(FDR),即错误发现率FDR (False discovery rate)的负对数值。对于X轴来说,偏离0越远说明表达量的倍数差越大;对于Y轴来说数值越大说明假阳性的概率越小,结果越可靠。火山图中红点为差异表达基因,黑点为表达量无差异的基因。

图 1 冬夏两季蒙古牛皮肤组织差异表达分析火山图 Figure 1 Volcano plot of differential expression analysis between W-skin and S-skin
2.6 差异表达基因的GO分类与富集分析

GO分类分析结果显示,“细胞组分”共注释到75个基因,“分子功能”共注释到63个基因而“生物学过程”共注释到65个基因。详见图 2

图 2 冬季蒙古牛与夏季蒙古牛皮肤组织的DEGs的GO分类 Figure 2 GO classification of DEGs between W-skin and S-skin

通过超几何分析法分别计算上述3类GO分类中各功能类别的P值对差异表达基因进行GO富集分析(表 5),富集条件为P值 < 0.01。P值越小说明差异表达基因在该条目中富集越显著。经过GO富集分析,细胞组分共富集到21个条目,分子功能共富集到39个条目,生物学过程共富集到224个条目。表 5中列出各类别中富集最显著的10个条目,细胞组分中有6个与脂类及脂蛋白相关(GO:0072562, GO:0034364, GO:0032994, GO:0034358, GO:0034361, GO:0034385),分子功能中有8个与酶活性相关(GO:0004866, GO:0061135, GO:0004857, GO:0030414, GO:0004867, GO:0005102, GO:0061134, GO:0030234),与之相对应,生物学过程中有6个与酶反应相关(GO:0051346, GO:0010951, GO:0043086, GO:0045861, GO:0051336, GO:0010466)。

表 5 冬夏两季蒙古牛皮肤组织差异表达基因GO富集分析最显著的前10条目 Table 5 The top10 GO enrichment terms of DEGs between W-skin and S-skin
2.7 差异表达基因的KEGG富集分析

通过超几何分析法计算KEGG各功能类别的P值来对DEGs进行KEGG富集分析,富集条件为P值 < 0.05。P值越小说明差异表达基因在该类别中富集越显著。经KEGG分析后共富集到23个信号通路,其中2个与凝血相关(bta04610, bta04611), 2个与脂类运输和代谢相关(bta00591,bta03320),2个与细胞色素P450相关(bta00980和bta00982)。除此之外,视黄醇代谢(bta00830),类固醇激素合成(bta00140)和与黑色素合成相关的酪氨酸代谢(bta00350)等代谢通路也有明显富集(表 6)。

表 6 冬夏两季蒙古牛皮肤组织差异表达基因KEGG富集分析结果 Table 6 KEGG enrichment analysis results of DEG between W-skin and S-skin
2.8 测序结果可靠性分析

对8个DEGs进行Real-time PCR验证,结果显示虽然个别基因的Real-time PCR结果与RNA-Seq结果相比差异倍数存在偏差,但两者之间的上下调表达趋势一致。因此,RNA-Seq结果可靠,Real-time PCR与RNA-Seq比较结果见图 3

图 3 RNA-Seq与Real-time PCR结果比较 Figure 3 Comparison of the RNA-Seq and real-time PCR results
2.9 候选基因筛选

根据基因的差异表达分析结果、GO和KEGG富集分析结果,共筛选出8个与蒙古牛抗寒相关的候选基因。与脂质转运和代谢相关的基因:FABP1和 ADIPOQ;与凝血相关的基因FGA、FGBFGG;与黑色素合成限速酶基因TYRP1和 DCT;与毛发生长相关基因LOC101906373 (Keratin-associated protein 8-1)。以上基因的差异表达情况见表 7

表 7 候选基因的差异表达 Table 7 Differential expression of candidate genes
3 讨论 3.1 研究对象及组织的选择

皮肤是人和哺乳动物最大的器官,同时它也是重要的感觉器官,感知外界的温度、湿度和机械损伤等,所以皮肤与动物对环境和温度的适应能力息息相关。本研究以冬夏两季蒙古牛的皮肤组织为对象,研究皮肤组织在蒙古牛适应寒冷过程中发挥的作用及其分子机制。本研究中选取的冬夏蒙古牛两季共计6头,他们相互之间没有亲缘关系,以求屏蔽亲缘关系引起的基因差异表达;冬季组以及夏季组对青年期、壮年期和老年期的蒙古牛都有选取,以求屏蔽由年龄引起的基因差异表达;冬季组以及夏季组对公牛和母牛都有选取,以求屏蔽由性别引起的基因差异表达。

3.2 与参考基因组比对

冬季组和夏季组样本与参考基因组的总比对率高(分别为97.96%和99.19%),唯一比对率不高,但也在正常值内(分别为73.21%和75.55%),而多位点比对率略高(分别为13.62%和12.65%)。造成这种结果的原因可能有3种:(1)参考基因组完整度低。蒙古牛为非模式生物,其基因组完整度比模式生物的完整度要低;(2)文库中短序列略多。某些短序列由于读长较短的关系可能与多个位点都存在映射关系(3)种:文库中长序列略多。由于真核生物基因中存在内含子,mRNA在基因组上的分布是不连续的,且常存在可变剪接等情况,使得某些reads与参考基因组上的多个位点都存在映射关系。由于后续试验中只使用唯一比对的reads,为了避免唯一比对率略低造成的对参考基因组覆盖不全的问题,本研究采取扩大测序量的方法,提高了长度适中的、唯一比对的reads总量来扩大数据对参考基因组的覆盖,该问题得以解决,不影响后续分析。

3.3 GO富集

GO数据库[22]适用于各个物种,能对基因、蛋白质进行限定和描述。本研究DEGs GO富集分析中,细胞组分、分子功能和生物学过程类别中富集了大量的与脂类及脂蛋白相关,与酶活性和酶反应相关的类别,说明冬夏两季蒙古牛皮肤组织在脂类合成和运输以及在酶活性调节方面可能存在明显差异。

3.4 KEGG富集

KEGG Pathway分析[23]可以用于获得DEGs所涉及到的信号通路,通过基因代谢通路的分析可以进一步了解这些基因的生物学功能。本研究的DEGs KEGG富集分析中,凝血相关通路、脂类运输和代谢相关通路、视黄醇代谢通路和与黑色素合成相关的酪氨酸代谢通路等被显著富集。

3.4.1 凝血相关通路

哺乳动物抗寒的主要策略除了增加产热外还有一种是减少体温损耗,而减少体温损耗通常是以减少外周组织血液循环量实现的[24-26]。对北极熊和雅库特马的基因组学研究发现,血液凝集相关基因在它们对所处地区寒冷环境适应性进化的过程中被正向选择[27-28]。因此冬季蒙古牛皮肤组织中的血液凝集相关基因上调表达可能在减少皮下血管血液循环,减少体温散失方面发挥重要作用。

3.4.2 脂类运输和代谢相关通路

哺乳动物皮肤具有皮脂腺,皮脂腺可进行脂肪酸从头合成,其分泌的脂质具有保护表皮、毛发,抗微生物和抗氧化的作用[29]。因此,本研究中与夏季组相比冬季组蒙古牛皮肤组织中与脂类代谢相关的通路与基因明显上调表达,脂类代谢活跃,可能有利于对皮肤组织的保护。

3.4.3 黑色素合成相关的酪氨酸代谢通路

以减少外周组织血液流量来对抗寒冷的代价之一是增强了体内氧化应激,使ROS(活性氧簇)水平升高[30],高浓度的ROS对组织和细胞具有破坏作用。H2O2是ROS组成成分之一,除了超氧自由基的歧化外,H2O2还可以通过黑色素合成过程中的中间体聚合反应作为副产物被产出[31]。因此,冬季蒙古牛皮肤组织中黑色素合成相关的酪氨酸代谢通路以及该通路中的关键限速酶TYRP1和DCT的下调表达,可能有助于减少皮肤组织中H2O2的水平,减少氧化应激对机体的损伤。

3.5 候选基因

FABP1和ADIPOQ在调节脂质代谢方面发挥重要作用。FABP1属于脂肪酸结合蛋白(FABPs)家族成员,其mRNA在哺乳动物的肝、小肠、肾和肺等组织广泛分布[32-34]FABP1作用是结合脂肪酸及其衍生物,调节机体脂质平衡[35-36]。脂联素(Adiponectin)又称ADIPOQ,它是一种激素蛋白,可以增强脂肪酸氧化和葡萄糖的摄取[37]

纤维蛋白原(Fibrinogen),有称凝血因子I,为对称的二聚体糖蛋白,每个蛋白单体由Aα、Bβ、γ 3条多肽链构成,这3条多肽链分别由FGAFGBFGG 3个基因编码[38]。纤维蛋白原可以促进血小板的聚集, 增加血液黏滞性和外周阻力,使血流速度减慢。本研究中与S-skin相比W-skin中的FGA、FGB、FGG都上调表达,说明冬季蒙古牛皮肤组织中的纤维蛋白酶原表达量比夏季组高, 蒙古牛可能通过减少皮下血管血液流速的方式降低体温消散。

LOC101906373(Keratin-associated protein 8-1)是角蛋白相关蛋白的一种。角蛋白(KRT)和角蛋白相关蛋白(KAP)是毛发合成所需的主要蛋白,KRT有酸型和基础型两类[39-40],KAP根据其氨基酸成分可分为3类,分别为高硫型(HS)、超高硫型(UHS)和高甘氨酸型(HGT)[41],LOC101906373属于HGT。在毛发生成过程中HGT KAP的表达晚于KRT[42-44],以决定毛发的弯曲程度以及机械强度[45-46]。与S-skin相比,W-skin中LOC101906373上调表达,说明蒙古牛毛发合成在冬季明显增加以助其越冬,并且LOC101906373可能在该过程中发挥重要作用。

4 结论

本研究利用Ion Proton TM Sequencer对冬季蒙古牛和夏季蒙古牛的皮肤组织进行转录组测序,经过分析后得出初步结论:凝血相关通路、脂类运输和代谢相关通路及与黑色素合成相关的酪氨酸可能与蒙古牛抗寒能力有关;候选基因FABP1、ADIPOQFGAFGBFGGTYRP1、DCT、LOC101906373可能在蒙古牛抗寒过程中发挥重要作用。

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