茸角是哺乳动物中唯一能够完全再生的组织器官，其再生源于角柄四周的骨膜干细胞，被称之为角柄骨膜干细胞(Pedicle periosteum cells)，简称PP细胞^[1]。在一定激素与环境的调节下^[2]，PP细胞逐步分化为间充质干细胞、前软骨母细胞、软骨细胞、骨细胞，而再生成为完整的茸角组织，待至8~9月份，随着矿物质的大量沉积，骨组织完全取代软骨组织，进而使其快速骨化为角，同时伴随着茸皮褪去，血管、神经退化^[3]，成为一“死”角，但有研究显示骨化完全的鹿角组织中仍存有血管与骨细胞^[4]。

通常将骨化的鹿茸称之为鹿角，其性微温、味咸、无毒，与鹿茸有着同样的药理作用，如抗骨质疏松、抗炎、促进伤口愈合、抗癌^[5]等，只是功效明显弱于鹿茸。但鹿角对于某些疾病的治疗作用却有着明显的优势，如乳腺增生、乳腺炎、子宫平滑肌瘤、恶性褥疮及小儿腮腺炎等^[6-7]。药用鹿骨通常为雄鹿剔去肉的骨头，味甘，微热，没有毒性，具有功能^[8-10]。但目前对鹿角与鹿骨的研究主要集中在矿物质、激素、氨基酸等水平，对其蛋白质组分的了解甚少。

非标记(Label-free)定量蛋白质组学近年来成为了重要的质谱定量方法，相比与iTRAQ等稳定同位素标记的定量蛋白质组学技术，Label-free能够鉴定到更多种类的蛋白质，特别适用于样品差异比较大的试验^[11]。其原理首先是对每个LC-MS数据中的肽段信号进行识别并定量，然后使用Maxquant软件^[12]内置的Andromeda算法^[13]对所有肽段信号的MS²进行数据库检索，完成定性工作，最后整合所有的定性定量数据，完成整个定量蛋白质组学数据工作。

为系统性的分析鹿角所特有的药理活性成分，本研究将鹿角与鹿骨做对照，利用Label-free定量蛋白质组学技术，分析、比较鹿角与鹿骨的蛋白质组分，试图筛选出鹿角所特有的药理活性物质。

1 材料与方法 1.1 试验材料

丙酮、DTT、Urea、IAA来自美国Bio-Rad公司；Tris-HCl来自上海碧云天生物技术有限公司；NH₄HCO₃来自Sigma公司；Trypsin来自Promaga；甲酸、乙腈购于Fisher公司；C18-SD Extraction Disk Cartridge脱盐柱购于Thermo公司；试验中所用的水均为去离子水。

鹿角为7岁天山马鹿生长到130天的鹿角；鹿骨为同1只天山马鹿的股骨，并直接简称为鹿骨。

1.2 蛋白质提取

新鲜的马鹿鹿角、鹿骨样品各1 g，液氮研磨为粉末状，加10 mL 10% TCA/丙酮，-20 ℃条件下沉淀2 h，每半小时旋涡震荡1 min。12 000 g、4 ℃离心10 min，弃上清。加10 mL 80%预冷丙酮洗涤，离心，去上清，室温干燥2 min。加入5 mL SDT裂解液(4% (w/v) SDS, 100 mmol·L^-1 Tris-HCl pH 7.6，100 mmol·L^-1 DTT)，超声处理5 min。12 000 g离心20 min，取上清。BCA法测定蛋白质浓度，-80 ℃保存备用。

1.3 蛋白质酶解

取200 μg蛋白质样品，加入50 μL 100 mmol·L^-1 DTT，55℃水浴30 min，冷却至室温。加入200 μL UA裂解液(8 mol·L^-1 Urea，150 mmol·L^-1 Tris-HCl pH8.0)，混匀，转入30 kD超滤离心管，14 000 g离心15 min。加入120 μL 100 mmol·L^-1 IAA，振荡1 min，室温避光30 min，14 000 g离心10 min。加入100 μL UA裂解液，14 000 g离心10 min。加入100 μL 50 mmol·L^-1 NH₄HCO₃水溶液，14 000 g离心10 min。加入2 μg胰蛋白酶，振荡1 min，37 ℃酶解16 h。换新收集管，离心，收集滤液，滤液经C18-SD Extraction Disk Cartridge脱盐处理，OD_{280 nm}定量^[14]。

1.4 质谱检测

取100 μg酶解后产物进行质谱分析，每个样品进样3次。采用EASY-nLC1000液相系统进行分离。流动相水相A液为0.1%甲酸-乙腈水溶液(乙腈为2%)，有机相B液为0.1%甲酸-乙腈水溶液(乙腈为80%)。色谱柱Thermo EASY column SC200 150 μm*100 mm (RP-C18)以100%的A液平衡，流速为400 nL·min^-1。液相梯度：0~95 min，B液线性梯度从0%到45%；95~105 min，B液线性梯度从45%到90%；105~110 min，B液维持在90%。酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。检测方式：正离子，母离子扫描范围：300~1 800，每次全扫描(Full scan)后采集20个碎片图谱(MS² scan，HCD)。

1.5 Maxquant的非标记分析

LC-MS/MS原始文件导入Maxquant软件(版本号1.3.0.5)进行查库，进行LFQ非标定量分析。数据库为uniprot_Bovine _24148_20151124.fasta(收录序列24 148条，下载于2015-11-24)，酶解方式为胰蛋白酶，固定修饰选择烷基化修饰(Carbamidomethyl)，可变修饰为氧化修饰(Oxidation)与乙酰化修饰(Acetyl)。

1.6 生物信息学分析

运用ClueGO(v2.3.2)软件对蛋白质做GO功能分析。ClueGO是Cytoscape的一个插件，能全面揭示蛋白参与的生物进程，进而有效提高对大数据的解析能力^[15]。物种选择Bos Taurus，biological process数据库下载于2017年02月27日，含有13 279个term。输入鉴定蛋白的UniprotKB-AC号，勾选GO term fusion选项，统计检验采用超几何富集分析Enrichment two-sided hypergeometric test，校正方法是多重比较Bonferroni step down；P＜0.05；GO term interval为3~8，Kappa得分的阈值设为0.4，每个group至少有1个term(Initial Group Size为1)。

2 结果 2.1 蛋白质鉴定

利用Label-free定量蛋白组学技术共成功鉴定1 138种蛋白质，其中鹿骨蛋白934种，包含5种未知结构蛋白(E1BC32、E1BJ81、E1BLT1、F1MY81、G3MYJ0)；鹿角蛋白835种，包含4种未知结构蛋白(E1BJ81、E1BLT1、F1MY81、F1N6P2)。鹿角与鹿骨的共有蛋白质为637种(56%)，这部分蛋白通常被称为核心蛋白(“core”protein)；鹿骨与鹿角特有蛋白分别为301和200种。鉴定到的蛋白质分子量范围为6~590 ku。

2.2 蛋白质功能富集

934种鹿骨蛋白质中有880种被ClueGO识别，并成功注释了853种，注释成功率为96.93%；835种鹿角蛋白质中有792种被ClueGO识别，并成功注释了759种，注释成功率为95.83%。注释结果显示，鹿骨蛋白组分与鹿角蛋白组分的富集通路有着较大区别，其中鹿骨蛋白特异富集到了氧化还原、嘌呤核苷酸合成、细胞组分组装、蛋白定位、低密度脂蛋白受体代谢、黑质体发育、血管再生、RNA剪切、细胞凋亡信号通路调节等过程；而鹿角特有蛋白富集到了蛋白酶解、蛋白折叠、肽类激素加工过程、活化T细胞增殖调节等生物学过程，其中肽类激素加工过程主要蛋白有CPE、CPN1、ECE1；活化T细胞增殖调节蛋白主要有IGF2、PRKAR1A、PYCARD(图 1)。

2.3 差异蛋白质分析

利用SPSS软件筛选鹿角与鹿骨显著差异表达蛋白(差异倍数＞2，P＜0.05)，共筛选出差异蛋白质335种，其中75种蛋白在鹿骨组织中表达上调，富集到了3个生物学过程，分别为肌原纤维组装、杀菌、肌动蛋白丝组装；260种蛋白在鹿角组织中表达上调，富集到了多个生物学过程，包括了内肽酶活性负调控、蛋白活化过程、细胞氧化解毒、氧化还原、骨化、甘油三酯代谢、柠檬酸代谢等。另外，发现了3种抗菌肽蛋白在鹿角与鹿骨组织中的表达差异显著，分别为抗菌肽1 (cathelicidin 1)、抗菌肽5(cathelicidin 5)与抗菌肽6(cathelicidin 6)，由图 2、图 3可知，cathelicidin 1与cathelicidin 5在鹿角中为高表达，而cathelicidin 6在鹿骨中高表达。

3 讨论

鹿茸是哺乳动物中唯一能够完全再生的组织器官，也是一种由软骨与骨组织构成的组织器官，为更清楚的了解鹿茸的特有生物活性成分，首先试图了解鹿茸与真正的骨组织蛋白组分上有着怎样的差异。而鹿角是鹿茸完全骨化的一种状态，此时茸皮也已脱落，是与鹿骨最为接近的鹿茸生长状态。

为充分解析鹿角与鹿骨蛋白组分，我们使用Label-free高通量蛋白质组研究技术。试验结果显示，鉴定到的鹿角蛋白质与鹿骨蛋白质种类数量相近，而且有56%的蛋白质为核心蛋白。但由于鹿角与鹿骨不同的代谢需求，这些蛋白质的表达量也有着差异。在鹿角组织中随着矿物质的迅速沉积，在其软骨支架的基础上会形成骨小梁结构，进而彻底完成鹿角的骨化过程^[16]，所以甘油三酯代谢、柠檬酸代谢、骨化等相关蛋白在此时的鹿角组织中的表达量会相对较高。另外，由试验结果发现，具有抗微生物活性的蛋白质Cathelicidins在鹿角与鹿骨组织中皆有表达，说明鹿角与鹿骨都有较完善的免疫系统^[17]，其中鹿角中Cathelicidins的表达很可能是防止在茸皮脱落后微生物对鹿角的侵染。然而，笔者发现不同类型的Cathelicidins在两种组织中的表达趋势不一致，cathelicidin 6通常储存于骨髓中^[18]，进而在鹿骨中表达上调，而cathelicidin 1与cahtelicidin 5通常存在于大颗粒的嗜中性粒细胞中^[19]，因而在鹿角组织中表达上调。

另外，鹿角与鹿骨组织蛋白组分的GO富集分类有着显著的不同，其中鹿骨蛋白特异富集到了氧化还原、嘌呤核苷酸合成、细胞组分组装、蛋白定位、低密度脂蛋白受体代谢、黑质体发育、血管再生、RNA剪切、细胞凋亡信号通路调节等过程；而鹿角蛋白特异富集到了蛋白酶解、蛋白折叠、肽类激素加工过程、活化T细胞增殖调节等生物学过程；而这也进一步说明了鹿角组织像鹿骨一样，需要进行骨组织的新陈代谢，并不会由于茸皮的脱落而彻底变为一死组织。另外鹿角组织中还独特表达了多种与肿瘤相关的蛋白，如参与肽类激素加工过程的羧肽酶E，为多种激素肽和神经递质生物合成过程中最主要的羧肽酶，在促进肿瘤生长、侵袭及转移中发挥重要作用^[20]。Pleiotrophin作为一个原癌基因，也与肿瘤的发生和发展关系密切^[21]，而Calcyclin-binding protein则可结合S100A1、S100A6、S100A12等钙周期蛋白^[22]，在正常组织中表达水平较低，往往检测不到，但却几乎存在于所有的肿瘤组织中^[23-24]，这两种鹿角特有蛋白可能与鹿角的生长发育相关。活化T细胞增殖是免疫应答的中心环节，在鹿角中共发现了3种特有表达的T细胞增殖相关蛋白，其中IGF2与细胞凋亡相关蛋白(PYCARD)能够正调控活化T细胞的增殖过程^[25]，但PRKAR1A对活化T细胞增殖过程却是负调节作用^[26]，说明鹿角对于活化T细胞增殖的调控是双向的。

4 结论

本研究对鹿角、鹿骨的蛋白质组分做了初步探究，发现鹿角与鹿骨虽然同样是骨组织，但其蛋白质组分中仅有56%(637种)的共表达蛋白，并在鹿角组织中发现了与肽类激素加工、活化T细胞增殖相关蛋白的特有表达，如羧肽酶E、Pleiotrophin、Calcyclin-binding protein、IGF2、PYCARD、PRKAR1A。该试验结果为鹿茸、鹿角药理活性物质的深度挖掘奠定理论基础。