表 1(Table 1)
图 1(Figure 1)
从江香猪FoxO 4基因真核表达载体的构建及其在皮下脂肪前体细胞中的表达
引用本文
孙成娟,
许厚强,
段志强,
陈伟,
赵佳福,
周迪.
从江香猪FoxO 4基因真核表达载体的构建及其在皮下脂肪前体细胞中的表达[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(12): 2268-2276.
SUN Cheng-juan,
XU Hou-qiang,
DUAN Zhi-qiang,
CHEN Wei,
ZHAO Jia-fu,
ZHOU Di.
Construction of Recombinant Eukaryotic Expression Vector of FoxO 4 Gene from Congjiang Xiang Pig and Its Expression in Subcutaneous Preadipocytes[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2017, 48(12): 2268-2276.
从江香猪FoxO 4基因真核表达载体的构建及其在皮下脂肪前体细胞中的表达
1. 贵州大学 高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室, 贵阳 550025;
2. 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室, 贵阳 550025;
3. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025;
4. 贵州大学生命科学学院, 贵阳 550025
2. 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室, 贵阳 550025;
3. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025;
4. 贵州大学生命科学学院, 贵阳 550025
摘要：本研究旨在克隆从江香猪FoxO 4基因编码区序列，对FoxO 4基因功能进行初步探究。采用qRT-PCR技术对从江香猪（6月龄）不同组织中FoxO 4基因的相对表达量进行检测；PCR扩增FoxO 4基因CDS区，构建真核表达载体pEGFP-N3-FoxO4；利用脂质体法将重组质粒pEGFP-N3-FoxO4瞬时转染从江香猪皮下脂肪前体细胞，通过qRT-PCR方法，检测FoxO 4、PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL的表达水平。结果显示：FoxO 4基因在从江香猪脂肪组织中表达量最高；构建的重组真核表达载体pEGFP-N3-FoxO4在从江香猪皮下脂肪前体细胞中成功表达，与对照组相比，LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL基因的表达均显著上调。综上表明，FoxO 4对脂质代谢具有一定的调控作用，可能是影响从江香猪猪肉品质的重要候选基因，为进一步了解从江香猪脂肪沉积机制提供理论基础。
关键词：FoxO 4基因 真核表达载体 皮下脂肪前体细胞 从江香猪
Construction of Recombinant Eukaryotic Expression Vector of FoxO 4 Gene from Congjiang Xiang Pig and Its Expression in Subcutaneous Preadipocytes
1. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region of Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
2. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in Guizhou, Guiyang 550025, China;
3. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
4. College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China
2. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in Guizhou, Guiyang 550025, China;
3. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
4. College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China
Abstract: The aim of this study was to clone the coding sequence of FoxO 4 gene of Congjiang Xiang pig and preliminarily explore the function of FoxO 4 gene. The relative expression level of FoxO 4 gene was detected by qRT-PCR in different tissues of Congjiang Xiang pig at the age of 6 month.The recombinant plasmid pEGFP-N3-FoxO4 was constructed by inserting the FoxO 4 gene coding sequence into pEGFP-N3, and then transiently transfected into the subcutaneous preadipocytes of Congjiang Xiang pig by liposome-mediated transfection.The expression levels of FoxO 4, PPARγ, LPL, FAS, ACC, ATGL, HSL in transfected cells were detected by qRT-PCR. The results showed that FoxO 4 gene had the highest expression level in adipose tissue. The constructed plasmid pEGFP-N3-FoxO4 was successfully expressed in subcutaneous preadipocytes. The expression level of LPL, FAS, ACC, ATGL and HSL genes were significantly up-regulated in the subcutaneous preadipocytes when compared to the control group.These results revealed that FoxO 4 gene had certain regulation on fat deposition and might be a key candidate gene for the pork quality, which will provide theoretical basis for further studying the mechanism of fat deposition.
Key words:
FoxO 4 gene
eukaryotic expression vector
subcutaneous preadipocyte
Congjiang Xiang pig
FoxO转录因子家族是叉头转录因子(Forkhead transcription factors, Fox)的一个亚类，具有一个保守的FH (Forkhead)域，称为DNA结合结构域[1]。1997年，在线虫中首次克隆出了FoxO家族转录因子[2]。在哺乳动物中FoxO家族包括4个成员，分别为FoxO 1、FoxO 3、FoxO 4和FoxO 6[3]，在细胞周期控制、细胞分化、衰老、应激反应、细胞凋亡、肿瘤形成和DNA损伤修复中起重要作用[4-5]。FoxO存在于多种细胞内且参与多种生理过程，FoxO家族在胰岛素或胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)下游生长因子受体表达过程中发挥重要作用[6]。虽然FoxO家族成员之间具有不同程度分子结构和生理效应上的相似性，然而各成员在组织中表达并不均衡，提示不同FoxO家族成员分子具有独特的细胞功能[7]。相关研究表明，FoxO 1主要与成肌细胞的分化及脂肪细胞代谢有关，而FoxO 3主要参与细胞的凋亡、分化和增殖，FoxO 4与葡萄糖代谢有关，而FoxO 6与胃癌细胞的增殖密切相关[8-12]。FoxO 4(Forkhead transcription factor O4, FoxO 4)作为FoxO家族中的成员之一，最初是在X染色体上发现的。编码猪FoxO 4的基因定位于X染色体13q.1，总长度为1 539 bp，包含2个外显子和1个内含子，编码的蛋白由501个氨基酸组成，受Akt /蛋白激酶B(PKB)信号通路的调控。FoxO 4基因在胃癌、肠癌方面的报道较多；在肉质方面研究报道较少。王玲[13]在西杂牛4个不同月龄牛群体中，荧光定量PCR分析发现FoxO 4基因表达量与肌纤维直径和肌纤维面积呈显著负相关。因此，在猪上，FoxO 4可能对猪的肉质品质也具有一定的影响。
本研究采用荧光定量PCR技术对FoxO 4基因进行差异表达分析；克隆从江香猪FoxO 4基因的完整CDS区，构建真核表达载体pEGFP-N3-FoxO4；采用胶原酶消化法，成功培养从江香猪皮下脂肪前体细胞；重组质粒pEGFP-N3-FoxO4瞬时转染皮下脂肪前体细胞，利用qRT-PCR方法检测FoxO 4基因过表达后，脂肪分化相关基因PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL的mRNA水平变化情况。进一步挖掘与猪肉质性状相关基因，对改善猪肉品质，提高猪肉质量具有重要意义。
1 材料与方法 1.1 材料Trizol试剂、限制性内切酶Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ、T4 DNA连接酶、DMEM/F12培养基、青链霉素、转染试剂LipofectamineTM 3000 CD Reagent、Opti-MEM培养基、Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒均购自美国Life technologies公司；DL2000 marker、DL5000 marker、DL15000 marker购自TaKaRa公司；琼脂糖、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂粉均购于上海生工生物股份有限公司；2×Es Taq MasterMix、LB培养基、氨苄青霉素、硫酸卡纳霉素、X-gal、200目细胞筛、细胞培养瓶、细胞培养板、PBS均购自北京康为世纪生物科技有限公司；SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)试剂盒购自美国Axygen公司；0.1%Ⅰ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清均购于GIBCO公司；胰岛素、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、油红O染料、二甲基亚砜均购自Sigma公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。
1.2 方法 1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成试验样品采自贵州大学香猪育种场，采集6月龄从江香猪的心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌、脂肪9个组织样，采样部位严格按照中国地方猪品种生产性能测定的技术规范实施。利用Trizol法提取组织总RNA。用超微量紫外可见分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。使用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒，反转录合成cDNA。
1.2.2 qRT-PCR及数据分析以GAPDH作为qRT-PCR的内参基因，参照GenBank收录的FoxO 4和GAPDH基因的mRNA序列，运用Primer 5.0软件和Oligo软件设计特异性引物，引物由生工生物工程股份(上海)有限公司合成，引物参数详见表 1，退火温度为59 ℃。利用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)试剂盒进行实时荧光定量PCR，反应体系为20 μL。采用2-ΔΔCt方法处理数据，Spass软件分析FoxO 4基因在从江香猪不同组织样中的差异表达。
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表 1 FoxO 4，GAPDH基因荧光定量PCR引物 Table 1 Primers for real-time PCR of FoxO 4 and GAPDH genes |
根据GenBank中公布的猪FoxO 4(登录号：XM_003135172.3)基因序列，用Primer 5.0设计含有酶切位点的引物。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物参数详见表 2。以cDNA为模板，PCR扩增FoxO 4基因。
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表 2 FoxO 4基因的引物参数 Table 2 Primer parameters amplifying FoxO 4 gene |
将FoxO 4基因的切胶回收纯化产物与pEGFP-N3载体连接，连接产物转化至大肠杆菌E. coli DH5α感受态细胞中，均匀涂布于含50 μg·mL-1卡那霉素的固体培养基上，过夜培养。在含卡纳霉素的LB固体培养基上挑取白色阳性菌落，摇菌，进一步扩大培养。待菌液浑浊，进行菌液PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，筛选阳性菌液。用质粒提取试剂盒提取重组质粒pEGFP-N3-FoxO4，限制性内切酶Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳检测，进一步确定重组质粒是否构建成功。将筛选的阳性菌液送生工生物工程股份(上海)有限公司测序鉴定。
1.2.5 从江香猪皮下脂肪前体细胞的原代培养参考文献[14]，选择5日龄从江香猪仔猪，进行麻醉，在无菌条件下迅速分离颈部皮下脂肪，放入含有抗生素的PBS中，去除肉眼可见的结缔组织和血管，剪成1~2 mm3的组织块。用0.1%Ⅰ型胶原酶，37 ℃水浴消化1 h，期间每10 min摇晃1次，使组织块分散均匀。经200目细胞筛过滤，1 500×g离心5 min，弃上清。沉淀用DMEM/F12(不含胎牛血清)培养液吹打，清洗，重复3次，以除去血细胞。最后，用含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12完全培养液重悬细胞沉淀，接种于细胞培养瓶中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
1.2.6 诱导分化及油红O染色皮下脂肪前体细胞传至2~3代，生长至80%~90%汇合时，再继续培养2~3 d，待细胞达到生长抑制后，加入脂肪细胞分化诱导培养基(10%FBS+5 μg·mL-1胰岛素+1 μmol·L-1地塞米松+0.5 mmol·L-1 3-异丁基-1甲基黄嘌呤)进行培养，培养72 h后，再换成脂肪细胞分化维持培养基(10%FBS+1 μg·mL-1胰岛素)培养，2 d换液1次，直至80%的细胞出现脂滴。油红O染色进一步鉴定。
1.2.7 pEGFP-N3-FoxO4瞬时转染皮下脂肪前体细胞利用脂质体LipofectamineTM 3000 CD Reagent转染重组质粒pEGFP-N3-FoxO4和空白质粒pEGFP-N3，每个样品3个重复。具体步骤：进行转染前，将细胞接种于6孔板中，待细胞生长至80%~90%且细胞生长状态良好时，细胞数量约为1×106个·孔-1，进行瞬时转染。DNA-脂质体复合物逐滴加入到细胞后，以十字交叉方式晃动培养板，混合均匀，置于5% CO2培养箱中培养4~6 h。吸弃转染复合物，加入完全培养基DMEM/F12，24 h即可观察细胞的转染情况。
1.2.8 qRT-PCR检测脂肪相关分化基因在皮下脂肪前体细胞的表达参照GenBank中PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL的基因序列，运用Primer 5.0软件和Oligo软件设计荧光特异性引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物的详细信息见表 3。
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表 3 基因荧光定量PCR引物 Table 3 Primers for real-time PCR of genes |
方差采用2-ΔΔCt方法处理数据，Spass软件进行分析，P＜0.05为差异显著；P＜0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 FoxO 4基因在从江香猪不同组织中的qRT-PCR分析以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt方法处理数据，Spass软件分析FoxO 4基因在从江香猪不同组织中的表达(图 1)。结果显示，FoxO 4基因mRNA在从江香猪所检测的9个组织样中均有表达，其中在脂肪组织中表达量极显著高于其他组织(P＜0.01)。
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不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)；相同字母表示无显著差异(P＞0.05) Different small letters and capital letters indicate significant differences (P < 0.05) and highly significant differences(P < 0.01), respectively; No obvious difference is indicated by the same letter (P > 0.05) 图 1 FoxO 4基因mRNA在从江香猪不同组织中的相对表达 Figure 1 The relative expression level of FoxO 4 gene in different tissues of Congjiang Xiang pig |
以逆转录的cDNA为模板，PCR扩增FoxO 4基因的完整CDS区，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，FoxO 4基因约在1 539 bp处出现明亮条带，与目的条带大小一致(图 2)。
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M.DL5000 marker；1~3.扩增的FoxO 4 M.DL5000 marker; 1-3.The PCR amplification of FoxO 4 图 2 FoxO 4基因的PCR扩增 Figure 2 The PCR amplification of FoxO 4 gene |
筛选的阳性菌液，经菌液PCR，扩增出大小约为1 539 bp的条带，与预期的FoxO 4片段大小一致(图 3)。
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M.DL5000 marker；1~4.扩增的FoxO 4产物 M.DL5000 marker; 1-4.The PCR amplification of FoxO 4 图 3 FoxO 4基因的菌液PCR扩增 Figure 3 The bacterial PCR amplification of FoxO 4 gene |
pEGFP-N3-FoxO4重组质粒的酶切结果获得两条带：大小约为4 700 bp的pEGFP-N3载体片段和1 539 bp的目的基因FoxO 4片段。结果表明，pEGFP-N3-FoxO4重组质粒构建成功(图 4)。
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M.DL 15000 marker；1、2.重组质粒pEGFP-N3-FoxO4的双酶切 M.DL 15000 marker; 1, 2. Double enzyme digestion of recombinant plasmid pEGFP-N3-FoxO4 图 4 pEGFP-N3-FoxO4重组质粒的双酶切鉴定 Figure 4 Identification of double enzyme digestion of recombinant plasmid pEGFP-N3-FoxO4 |
通过测序进一步验证，将测序结果与NCBI中的序列在BioXM 2.6软件上进行序列比对，吻合度达到99.9%。进一步表明真核表达载体pEGFP-N3-FoxO4构建成功(图略)。
2.6 皮下脂肪前体细胞的形态学观察从江香猪皮下脂肪前体细胞原代培养，细胞贴壁时间较长。接种8 h时，细胞呈圆形，很少贴壁(图 5A)；原代培养第8天，细胞汇合成单层细胞，呈梭形，细胞生长速度最快(图 5B)；原代培养第10天，细胞紧密平行排列，部分细胞开始出现分化趋势(图 5C)。
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A.8 h；B.8 d；C.10 d 图 5 皮下脂肪前体细胞的原代、传代培养(100×) Figure 5 Primary culture and subculture of subcutaneous preadipocyte (100×) |
分化诱导培养基诱导皮下脂肪前体细胞，诱导培养24 h时，细胞变成椭圆形或圆形(图 6A)；随着诱导时间的延长，出现大量的脂滴(图 6B)，待脂肪细胞成熟后用油红O染色鉴定，可清晰的看到被油红O染色的脂肪细胞(图 6C)。
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A.诱导培养24 h(100×)；B.诱导培养144 h(100×)；C.油红O染色(200×) A. Induced culture 24 h(100×); B. Induced culture 144 h(100×); C. Oil red O staining(200×) 图 6 皮下脂肪前体细胞的诱导分化及鉴定 Figure 6 Induced differentitation and identification of subcutaneous preadipocyte |
将pEGFP-N3-FoxO4重组质粒瞬时转染从江香猪皮下脂肪前体细胞，转染24 h后，在倒置显微镜中观察，可清晰看到发出绿色荧光的细胞，表明pEGFP-N3-FoxO4真核表达载体已经成功转入到细胞中(图 7)。
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A.空白对照；B.阴性对照；C.重组质粒pEGFP-N3-FoxO4 A. Blank control; B. Negative control; C. The recombinant plasmid of pEGFP-N3-FoxO4 图 7 皮下脂肪前体细胞的转染(100×) Figure 7 The transfection of subcutaneous preadipocyte(100×) |
以GAPDH为内参基因，采用RT-PCR方法检测转染重组质粒pEGFP-N3-FoxO4后，相关分化基因PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL在皮下脂肪前体细胞的表达情况。结果显示：在皮下脂肪前体细胞中，过表达FoxO 4后，ACC、LPL、FAS、ATGL基因的表达水平上调，极显著高于阴性对照组(P＜0.01)；HSL的表达水平也上调，显著高于阴性对照组(P＜0.05)，PPARγ的表达水平在转染前后差异不显著(P＞0.05)(图 8)。
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**.P＜0.01；*.P＜0.05 图 8 相关基因在皮下脂肪前体细胞中的表达 Figure 8 Expression of related genes in subcutaneous preadipocyte |
本研究采用qRT-PCR方法对FoxO 4基因在从江香猪心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌、脂肪9个组织样的mRNA表达量进行检测。结果表明，FoxO 4基因mRNA在从江香猪所检测的9个组织样中均有表达，其中在脂肪组织中表达量最高，在背最长肌组织中表达量最低。这一结果与J.Yu等[15]证实的在人上FoxO 4基因在骨骼肌中表达量较低的结果相一致, 而从江香猪FoxO 4基因在脂肪组织中高表达与T.Furuyama等[16]研究的FoxO 4基因在小鼠脂肪中表达量较高相一致。本研究以从江香猪皮下脂肪前体细胞为研究对象，在细胞水平上对FoxO 4基因的功能进行研究，为后续深入研究FoxO 4基因的功能奠定理论基础。
脂肪前体细胞作为一类未分化成熟的脂肪细胞，具有高度的增殖和分化能力，其向成熟脂肪细胞分化的过程是由一系列分化转录因子调控的，包括早期转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白β (CCAAT/enhancer-binding protein，C/EBPβ)、CCAAT增强子结合蛋白δ (CCAAT/enhancer-binding protein，C/EBPδ)等[17-18]。脂肪前体细胞在经历一系列细胞形态学和相关基因表达变化后，分化为成熟的脂肪细胞。在此过程中，甘油三脂代谢途径中的相关基因，如脂蛋白脂酶基因(Lipoprotein lipase，LPL)、脂肪酸合成酶基因(Fatty acid synthase，FAS)、乙酰辅酶A羧化酶基因(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)，甘油三酯水解酶基因(Adipose triacylglycerol lipase，ATGL)、激素敏感脂酶基因(Hormone-sensitive lipase，HSL)等发挥一系列重要作用。
脂肪代谢中的脂肪合成与分解，共同调节着脂肪的沉积。乙酰辅酶A(CoA)是合成脂肪酸的关键原料。ACC是乙酰CoA生成丙二酸单酰CoA的关键酶，在FAS的催化下，经过一系列加工，生成各种脂肪酸。LPL是甘油三酯(TAG)代谢中的关键酶，对脂肪沉积起着重要的调控作用。ATGL、HSL作为两种重要的脂解酶，其表达水平对脂肪的沉积也发挥着重要的作用。PPARγ作为脂肪细胞分化过程中的一个关键转录因子，下调PPARγ时，小鼠3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化受到明显的抑制[19]。LPL、FAS对脂肪沉积均起着重要的调控作用[20-21]。ACC缺失时，能抑制脂肪细胞中脂质积累[22]。ATGL在小鼠体内高表达时，小鼠中的脂肪量减少[23]。HSL的mRNA表达量或活性可用来预测肌内脂肪沉积[24]。因此本研究将重组质粒pEGFP-N3-FoxO4瞬时转染皮下脂肪前体细胞后，经qRT-PCR方法检测，过表达FoxO 4后脂肪细胞分化相关基因PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL的表达情况，实现了对FoxO 4基因功能的初步探究。
通过胶原酶消化法培养从江香猪皮下脂肪前体细胞，在胡艳霞等[25]、陈妍等[26]培养原代细胞研究的基础上，参考并改进，成功培养皮下脂肪前体细胞。原代培养的细胞状态良好，为成功转染重组质粒pEGFP-N3-FoxO4奠定基础。本研究将重组质粒pEGFP-N3-FoxO4瞬时转染皮下脂肪前体细胞后，各相关分化基因LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL的表达几乎均显著上调。这一结果与FoxO 4能诱导脂滴的积累，刺激脂肪酸的合成相一致[27]。本研究通过构建真核表达载体pEGFP-N3-FoxO4，瞬时转染皮下脂肪前体细胞，初步探究FoxO 4基因功能，可为后续转基因小鼠模型提供分子学依据，为进一步探究FoxO 4基因功能奠定基础。
4 结论本研究结果表明，FoxO 4基因在从江香猪脂肪组织中表达量最高；在皮下脂肪前体细胞中过表达FoxO 4基因后，显著上调脂肪相关分化基因PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL和HSL的表达水平，说明FoxO 4基因对脂肪代谢具有一定的调控作用。
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