畜牧兽医学报  2017, Vol. 48 Issue (12): 2268-2276. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2017.12.006    PDF    
从江香猪FoxO 4基因真核表达载体的构建及其在皮下脂肪前体细胞中的表达
孙成娟1,3, 许厚强1,2,3, 段志强1,3, 陈伟1,4, 赵佳福1,4, 周迪1,4     
1. 贵州大学 高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室, 贵阳 550025;
2. 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室, 贵阳 550025;
3. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025;
4. 贵州大学生命科学学院, 贵阳 550025
摘要:本研究旨在克隆从江香猪FoxO 4基因编码区序列,对FoxO 4基因功能进行初步探究。采用qRT-PCR技术对从江香猪(6月龄)不同组织中FoxO 4基因的相对表达量进行检测;PCR扩增FoxO 4基因CDS区,构建真核表达载体pEGFP-N3-FoxO4;利用脂质体法将重组质粒pEGFP-N3-FoxO4瞬时转染从江香猪皮下脂肪前体细胞,通过qRT-PCR方法,检测FoxO 4、PPARγLPLFASACCATGLHSL的表达水平。结果显示:FoxO 4基因在从江香猪脂肪组织中表达量最高;构建的重组真核表达载体pEGFP-N3-FoxO4在从江香猪皮下脂肪前体细胞中成功表达,与对照组相比,LPLFASACCATGLHSL基因的表达均显著上调。综上表明,FoxO 4对脂质代谢具有一定的调控作用,可能是影响从江香猪猪肉品质的重要候选基因,为进一步了解从江香猪脂肪沉积机制提供理论基础。
关键词FoxO 4基因    真核表达载体    皮下脂肪前体细胞    从江香猪    
Construction of Recombinant Eukaryotic Expression Vector of FoxO 4 Gene from Congjiang Xiang Pig and Its Expression in Subcutaneous Preadipocytes
SUN Cheng-juan1,3, XU Hou-qiang1,2,3, DUAN Zhi-qiang1,3, CHEN Wei1,4, ZHAO Jia-fu1,4, ZHOU Di1,4     
1. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region of Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
2. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in Guizhou, Guiyang 550025, China;
3. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
4. College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China
Abstract: The aim of this study was to clone the coding sequence of FoxO 4 gene of Congjiang Xiang pig and preliminarily explore the function of FoxO 4 gene. The relative expression level of FoxO 4 gene was detected by qRT-PCR in different tissues of Congjiang Xiang pig at the age of 6 month.The recombinant plasmid pEGFP-N3-FoxO4 was constructed by inserting the FoxO 4 gene coding sequence into pEGFP-N3, and then transiently transfected into the subcutaneous preadipocytes of Congjiang Xiang pig by liposome-mediated transfection.The expression levels of FoxO 4, PPARγ, LPL, FAS, ACC, ATGL, HSL in transfected cells were detected by qRT-PCR. The results showed that FoxO 4 gene had the highest expression level in adipose tissue. The constructed plasmid pEGFP-N3-FoxO4 was successfully expressed in subcutaneous preadipocytes. The expression level of LPL, FAS, ACC, ATGL and HSL genes were significantly up-regulated in the subcutaneous preadipocytes when compared to the control group.These results revealed that FoxO 4 gene had certain regulation on fat deposition and might be a key candidate gene for the pork quality, which will provide theoretical basis for further studying the mechanism of fat deposition.
Key words: FoxO 4 gene     eukaryotic expression vector     subcutaneous preadipocyte     Congjiang Xiang pig    

FoxO转录因子家族是叉头转录因子(Forkhead transcription factors, Fox)的一个亚类,具有一个保守的FH (Forkhead)域,称为DNA结合结构域[1]。1997年,在线虫中首次克隆出了FoxO家族转录因子[2]。在哺乳动物中FoxO家族包括4个成员,分别为FoxO 1、FoxO 3、FoxO 4和FoxO 6[3],在细胞周期控制、细胞分化、衰老、应激反应、细胞凋亡、肿瘤形成和DNA损伤修复中起重要作用[4-5]。FoxO存在于多种细胞内且参与多种生理过程,FoxO家族在胰岛素或胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)下游生长因子受体表达过程中发挥重要作用[6]。虽然FoxO家族成员之间具有不同程度分子结构和生理效应上的相似性,然而各成员在组织中表达并不均衡,提示不同FoxO家族成员分子具有独特的细胞功能[7]。相关研究表明,FoxO 1主要与成肌细胞的分化及脂肪细胞代谢有关,而FoxO 3主要参与细胞的凋亡、分化和增殖,FoxO 4与葡萄糖代谢有关,而FoxO 6与胃癌细胞的增殖密切相关[8-12]FoxO 4(Forkhead transcription factor O4, FoxO 4)作为FoxO家族中的成员之一,最初是在X染色体上发现的。编码猪FoxO 4的基因定位于X染色体13q.1,总长度为1 539 bp,包含2个外显子和1个内含子,编码的蛋白由501个氨基酸组成,受Akt /蛋白激酶B(PKB)信号通路的调控。FoxO 4基因在胃癌、肠癌方面的报道较多;在肉质方面研究报道较少。王玲[13]在西杂牛4个不同月龄牛群体中,荧光定量PCR分析发现FoxO 4基因表达量与肌纤维直径和肌纤维面积呈显著负相关。因此,在猪上,FoxO 4可能对猪的肉质品质也具有一定的影响。

本研究采用荧光定量PCR技术对FoxO 4基因进行差异表达分析;克隆从江香猪FoxO 4基因的完整CDS区,构建真核表达载体pEGFP-N3-FoxO4;采用胶原酶消化法,成功培养从江香猪皮下脂肪前体细胞;重组质粒pEGFP-N3-FoxO4瞬时转染皮下脂肪前体细胞,利用qRT-PCR方法检测FoxO 4基因过表达后,脂肪分化相关基因PPARγLPLFASACCATGLHSL的mRNA水平变化情况。进一步挖掘与猪肉质性状相关基因,对改善猪肉品质,提高猪肉质量具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 材料

Trizol试剂、限制性内切酶Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ、T4 DNA连接酶、DMEM/F12培养基、青链霉素、转染试剂LipofectamineTM 3000 CD Reagent、Opti-MEM培养基、Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒均购自美国Life technologies公司;DL2000 marker、DL5000 marker、DL15000 marker购自TaKaRa公司;琼脂糖、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂粉均购于上海生工生物股份有限公司;2×Es Taq MasterMix、LB培养基、氨苄青霉素、硫酸卡纳霉素、X-gal、200目细胞筛、细胞培养瓶、细胞培养板、PBS均购自北京康为世纪生物科技有限公司;SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)试剂盒购自美国Axygen公司;0.1%Ⅰ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清均购于GIBCO公司;胰岛素、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、油红O染料、二甲基亚砜均购自Sigma公司;无内毒素质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。

1.2 方法 1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成

试验样品采自贵州大学香猪育种场,采集6月龄从江香猪的心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌、脂肪9个组织样,采样部位严格按照中国地方猪品种生产性能测定的技术规范实施。利用Trizol法提取组织总RNA。用超微量紫外可见分光光度计测定总RNA的浓度和纯度,1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。使用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒,反转录合成cDNA。

1.2.2 qRT-PCR及数据分析

GAPDH作为qRT-PCR的内参基因,参照GenBank收录的FoxO 4和GAPDH基因的mRNA序列,运用Primer 5.0软件和Oligo软件设计特异性引物,引物由生工生物工程股份(上海)有限公司合成,引物参数详见表 1,退火温度为59 ℃。利用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)试剂盒进行实时荧光定量PCR,反应体系为20 μL。采用2-ΔΔCt方法处理数据,Spass软件分析FoxO 4基因在从江香猪不同组织样中的差异表达。

表 1 FoxO 4,GAPDH基因荧光定量PCR引物 Table 1 Primers for real-time PCR of FoxO 4 and GAPDH genes
1.2.3 PCR扩增FoxO 4基因

根据GenBank中公布的猪FoxO 4(登录号:XM_003135172.3)基因序列,用Primer 5.0设计含有酶切位点的引物。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,引物参数详见表 2。以cDNA为模板,PCR扩增FoxO 4基因。

表 2 FoxO 4基因的引物参数 Table 2 Primer parameters amplifying FoxO 4 gene
1.2.4 FoxO 4基因与pEGFP-N3载体的连接转化、鉴定

FoxO 4基因的切胶回收纯化产物与pEGFP-N3载体连接,连接产物转化至大肠杆菌E. coli DH5α感受态细胞中,均匀涂布于含50 μg·mL-1卡那霉素的固体培养基上,过夜培养。在含卡纳霉素的LB固体培养基上挑取白色阳性菌落,摇菌,进一步扩大培养。待菌液浑浊,进行菌液PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,筛选阳性菌液。用质粒提取试剂盒提取重组质粒pEGFP-N3-FoxO4,限制性内切酶Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ酶切,1%琼脂糖凝胶电泳检测,进一步确定重组质粒是否构建成功。将筛选的阳性菌液送生工生物工程股份(上海)有限公司测序鉴定。

1.2.5 从江香猪皮下脂肪前体细胞的原代培养

参考文献[14],选择5日龄从江香猪仔猪,进行麻醉,在无菌条件下迅速分离颈部皮下脂肪,放入含有抗生素的PBS中,去除肉眼可见的结缔组织和血管,剪成1~2 mm3的组织块。用0.1%Ⅰ型胶原酶,37 ℃水浴消化1 h,期间每10 min摇晃1次,使组织块分散均匀。经200目细胞筛过滤,1 500×g离心5 min,弃上清。沉淀用DMEM/F12(不含胎牛血清)培养液吹打,清洗,重复3次,以除去血细胞。最后,用含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12完全培养液重悬细胞沉淀,接种于细胞培养瓶中,置37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.6 诱导分化及油红O染色

皮下脂肪前体细胞传至2~3代,生长至80%~90%汇合时,再继续培养2~3 d,待细胞达到生长抑制后,加入脂肪细胞分化诱导培养基(10%FBS+5 μg·mL-1胰岛素+1 μmol·L-1地塞米松+0.5 mmol·L-1 3-异丁基-1甲基黄嘌呤)进行培养,培养72 h后,再换成脂肪细胞分化维持培养基(10%FBS+1 μg·mL-1胰岛素)培养,2 d换液1次,直至80%的细胞出现脂滴。油红O染色进一步鉴定。

1.2.7 pEGFP-N3-FoxO4瞬时转染皮下脂肪前体细胞

利用脂质体LipofectamineTM 3000 CD Reagent转染重组质粒pEGFP-N3-FoxO4和空白质粒pEGFP-N3,每个样品3个重复。具体步骤:进行转染前,将细胞接种于6孔板中,待细胞生长至80%~90%且细胞生长状态良好时,细胞数量约为1×106个·孔-1,进行瞬时转染。DNA-脂质体复合物逐滴加入到细胞后,以十字交叉方式晃动培养板,混合均匀,置于5% CO2培养箱中培养4~6 h。吸弃转染复合物,加入完全培养基DMEM/F12,24 h即可观察细胞的转染情况。

1.2.8 qRT-PCR检测脂肪相关分化基因在皮下脂肪前体细胞的表达

参照GenBank中PPARγLPLFASACCATGLHSL的基因序列,运用Primer 5.0软件和Oligo软件设计荧光特异性引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物的详细信息见表 3

表 3 基因荧光定量PCR引物 Table 3 Primers for real-time PCR of genes
1.2.9 数据处理

方差采用2-ΔΔCt方法处理数据,Spass软件进行分析,P<0.05为差异显著;P<0.01为差异极显著。

2 结果 2.1 FoxO 4基因在从江香猪不同组织中的qRT-PCR分析

GAPDH为内参基因,采用2-ΔΔCt方法处理数据,Spass软件分析FoxO 4基因在从江香猪不同组织中的表达(图 1)。结果显示,FoxO 4基因mRNA在从江香猪所检测的9个组织样中均有表达,其中在脂肪组织中表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05);不同大写字母表示差异极显著(P<0.01);相同字母表示无显著差异(P>0.05) Different small letters and capital letters indicate significant differences (P < 0.05) and highly significant differences(P < 0.01), respectively; No obvious difference is indicated by the same letter (P > 0.05) 图 1 FoxO 4基因mRNA在从江香猪不同组织中的相对表达 Figure 1 The relative expression level of FoxO 4 gene in different tissues of Congjiang Xiang pig
2.2 FoxO 4基因的PCR扩增

以逆转录的cDNA为模板,PCR扩增FoxO 4基因的完整CDS区,用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示,FoxO 4基因约在1 539 bp处出现明亮条带,与目的条带大小一致(图 2)。

M.DL5000 marker;1~3.扩增的FoxO 4 M.DL5000 marker; 1-3.The PCR amplification of FoxO 4 图 2 FoxO 4基因的PCR扩增 Figure 2 The PCR amplification of FoxO 4 gene
2.3 重组质粒pEGFP-N3-FoxO4的菌液PCR鉴定

筛选的阳性菌液,经菌液PCR,扩增出大小约为1 539 bp的条带,与预期的FoxO 4片段大小一致(图 3)。

M.DL5000 marker;1~4.扩增的FoxO 4产物 M.DL5000 marker; 1-4.The PCR amplification of FoxO 4 图 3 FoxO 4基因的菌液PCR扩增 Figure 3 The bacterial PCR amplification of FoxO 4 gene
2.4 重组质粒pEGFP-N3-FoxO4的酶切鉴定

pEGFP-N3-FoxO4重组质粒的酶切结果获得两条带:大小约为4 700 bp的pEGFP-N3载体片段和1 539 bp的目的基因FoxO 4片段。结果表明,pEGFP-N3-FoxO4重组质粒构建成功(图 4)。

M.DL 15000 marker;1、2.重组质粒pEGFP-N3-FoxO4的双酶切 M.DL 15000 marker; 1, 2. Double enzyme digestion of recombinant plasmid pEGFP-N3-FoxO4 图 4 pEGFP-N3-FoxO4重组质粒的双酶切鉴定 Figure 4 Identification of double enzyme digestion of recombinant plasmid pEGFP-N3-FoxO4
2.5 真核表达载体pEGFP-N3-FoxO4的测序鉴定

通过测序进一步验证,将测序结果与NCBI中的序列在BioXM 2.6软件上进行序列比对,吻合度达到99.9%。进一步表明真核表达载体pEGFP-N3-FoxO4构建成功(图略)。

2.6 皮下脂肪前体细胞的形态学观察

从江香猪皮下脂肪前体细胞原代培养,细胞贴壁时间较长。接种8 h时,细胞呈圆形,很少贴壁(图 5A);原代培养第8天,细胞汇合成单层细胞,呈梭形,细胞生长速度最快(图 5B);原代培养第10天,细胞紧密平行排列,部分细胞开始出现分化趋势(图 5C)。

A.8 h;B.8 d;C.10 d 图 5 皮下脂肪前体细胞的原代、传代培养(100×) Figure 5 Primary culture and subculture of subcutaneous preadipocyte (100×)
2.7 诱导分化及油红O染色

分化诱导培养基诱导皮下脂肪前体细胞,诱导培养24 h时,细胞变成椭圆形或圆形(图 6A);随着诱导时间的延长,出现大量的脂滴(图 6B),待脂肪细胞成熟后用油红O染色鉴定,可清晰的看到被油红O染色的脂肪细胞(图 6C)。

A.诱导培养24 h(100×);B.诱导培养144 h(100×);C.油红O染色(200×) A. Induced culture 24 h(100×); B. Induced culture 144 h(100×); C. Oil red O staining(200×) 图 6 皮下脂肪前体细胞的诱导分化及鉴定 Figure 6 Induced differentitation and identification of subcutaneous preadipocyte
2.8 pEGFP-N3-FoxO4在皮下脂肪前体细胞中的瞬时转染

将pEGFP-N3-FoxO4重组质粒瞬时转染从江香猪皮下脂肪前体细胞,转染24 h后,在倒置显微镜中观察,可清晰看到发出绿色荧光的细胞,表明pEGFP-N3-FoxO4真核表达载体已经成功转入到细胞中(图 7)。

A.空白对照;B.阴性对照;C.重组质粒pEGFP-N3-FoxO4 A. Blank control; B. Negative control; C. The recombinant plasmid of pEGFP-N3-FoxO4 图 7 皮下脂肪前体细胞的转染(100×) Figure 7 The transfection of subcutaneous preadipocyte(100×)
2.9 qRT-PCR检测相关基因在皮下脂肪前体细胞的表达

GAPDH为内参基因,采用RT-PCR方法检测转染重组质粒pEGFP-N3-FoxO4后,相关分化基因PPARγLPLFASACCATGLHSL在皮下脂肪前体细胞的表达情况。结果显示:在皮下脂肪前体细胞中,过表达FoxO 4后,ACCLPLFASATGL基因的表达水平上调,极显著高于阴性对照组(P<0.01);HSL的表达水平也上调,显著高于阴性对照组(P<0.05),PPARγ的表达水平在转染前后差异不显著(P>0.05)(图 8)。

**.P<0.01;*.P<0.05 图 8 相关基因在皮下脂肪前体细胞中的表达 Figure 8 Expression of related genes in subcutaneous preadipocyte
3 讨论

本研究采用qRT-PCR方法对FoxO 4基因在从江香猪心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长肌、脂肪9个组织样的mRNA表达量进行检测。结果表明,FoxO 4基因mRNA在从江香猪所检测的9个组织样中均有表达,其中在脂肪组织中表达量最高,在背最长肌组织中表达量最低。这一结果与J.Yu等[15]证实的在人上FoxO 4基因在骨骼肌中表达量较低的结果相一致, 而从江香猪FoxO 4基因在脂肪组织中高表达与T.Furuyama等[16]研究的FoxO 4基因在小鼠脂肪中表达量较高相一致。本研究以从江香猪皮下脂肪前体细胞为研究对象,在细胞水平上对FoxO 4基因的功能进行研究,为后续深入研究FoxO 4基因的功能奠定理论基础。

脂肪前体细胞作为一类未分化成熟的脂肪细胞,具有高度的增殖和分化能力,其向成熟脂肪细胞分化的过程是由一系列分化转录因子调控的,包括早期转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白β (CCAAT/enhancer-binding protein,C/EBPβ)、CCAAT增强子结合蛋白δ (CCAAT/enhancer-binding protein,C/EBPδ)等[17-18]。脂肪前体细胞在经历一系列细胞形态学和相关基因表达变化后,分化为成熟的脂肪细胞。在此过程中,甘油三脂代谢途径中的相关基因,如脂蛋白脂酶基因(Lipoprotein lipase,LPL)、脂肪酸合成酶基因(Fatty acid synthase,FAS)、乙酰辅酶A羧化酶基因(Acetyl-CoA carboxylase,ACC),甘油三酯水解酶基因(Adipose triacylglycerol lipase,ATGL)、激素敏感脂酶基因(Hormone-sensitive lipase,HSL)等发挥一系列重要作用。

脂肪代谢中的脂肪合成与分解,共同调节着脂肪的沉积。乙酰辅酶A(CoA)是合成脂肪酸的关键原料。ACC是乙酰CoA生成丙二酸单酰CoA的关键酶,在FAS的催化下,经过一系列加工,生成各种脂肪酸。LPL是甘油三酯(TAG)代谢中的关键酶,对脂肪沉积起着重要的调控作用。ATGL、HSL作为两种重要的脂解酶,其表达水平对脂肪的沉积也发挥着重要的作用。PPARγ作为脂肪细胞分化过程中的一个关键转录因子,下调PPARγ时,小鼠3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化受到明显的抑制[19]LPLFAS对脂肪沉积均起着重要的调控作用[20-21]ACC缺失时,能抑制脂肪细胞中脂质积累[22]ATGL在小鼠体内高表达时,小鼠中的脂肪量减少[23]HSL的mRNA表达量或活性可用来预测肌内脂肪沉积[24]。因此本研究将重组质粒pEGFP-N3-FoxO4瞬时转染皮下脂肪前体细胞后,经qRT-PCR方法检测,过表达FoxO 4后脂肪细胞分化相关基因PPARγLPLFASACCATGLHSL的表达情况,实现了对FoxO 4基因功能的初步探究。

通过胶原酶消化法培养从江香猪皮下脂肪前体细胞,在胡艳霞等[25]、陈妍等[26]培养原代细胞研究的基础上,参考并改进,成功培养皮下脂肪前体细胞。原代培养的细胞状态良好,为成功转染重组质粒pEGFP-N3-FoxO4奠定基础。本研究将重组质粒pEGFP-N3-FoxO4瞬时转染皮下脂肪前体细胞后,各相关分化基因LPLFASACCATGLHSL的表达几乎均显著上调。这一结果与FoxO 4能诱导脂滴的积累,刺激脂肪酸的合成相一致[27]。本研究通过构建真核表达载体pEGFP-N3-FoxO4,瞬时转染皮下脂肪前体细胞,初步探究FoxO 4基因功能,可为后续转基因小鼠模型提供分子学依据,为进一步探究FoxO 4基因功能奠定基础。

4 结论

本研究结果表明,FoxO 4基因在从江香猪脂肪组织中表达量最高;在皮下脂肪前体细胞中过表达FoxO 4基因后,显著上调脂肪相关分化基因PPARγLPLFASACCATGLHSL的表达水平,说明FoxO 4基因对脂肪代谢具有一定的调控作用。

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