鹿茸是雄性鹿科动物(驯鹿除外)的第二性征之一,是迄今为止发现的唯一可以完全年周期性再生的哺乳动物器官,为人类研究哺乳动物器官再生提供了完美模型[1]。鹿茸再生包括血管、神经、骨和皮肤的再生过程。研究发现,角柄(颅骨上永久性骨质残桩)骨质上覆盖的一层骨膜称之为角柄骨膜(pedicle periosteum,PP)是鹿茸再生的组织基础[2]。C. Li[3]通过LacZ基因标记追踪试验发现:PP所具有的再生出完整鹿茸的能力来源于鹿额外嵴上的生茸区骨膜(antlerogenic periosteum,AP)。AP组织是一片直径约2.5 cm,厚度2.5~3 mm的骨膜组织,包含角柄和鹿茸形成的所有信息,而紧邻AP组织的脸部骨膜(facial periosteum,FP)细胞却不具有鹿茸形成的能力[4]。公鹿进入青春期后,AP开始发育形成角柄和初角茸(鹿茸发生过程),角柄一旦形成,AP随即消失。进一步研究发现AP和PP细胞均具有干细胞特性,CD9、Oct4、SOX2和Nanog等干细胞标记物在二者都有表达,同时,AP和PP细胞都可以被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌肉前体细胞,其中AP细胞还可以被诱导为神经元细胞,因此可以说AP和PP细胞具有干细胞特性和分化多潜能性,鹿茸发生和再生都是以干细胞为基础的过程[5-7]。然而,异位移植试验发现AP能形成异位鹿茸,PP却不具备这种能力,C. Li等[8]推测导致PP不能形成异位茸的原因或许是因为由AP衍生而来的PP失去了强有力的促进血管形成的能力。因此我们可以得出:尽管AP和PP细胞都可以被称作“多能干细胞”,都具有形成完整鹿茸器官的能力,但是两种干细胞在细胞特性或功能(特别是促血管形成)方面存在差异。
为探究调控鹿茸发生和再生的分子机制,C. Y. Li等[9]通过2-DE试验和IPA软件对AP和PP细胞差异蛋白组学分析发现:PI3K/AKT信号通路在AP细胞(P < 0.001)和PP细胞(P=0.004)中均发挥着重要作用,在AP细胞中发挥的作用可能更为显著。但是,PI3K/AKT信号通路调控鹿茸干细胞(AP和PP细胞的统称)进行鹿茸发生和再生的机制还未清楚。研究发现,PI3K/AKT信号通路具有调控细胞增殖、生存、分化、周期和促血管形成等细胞活动和功能的作用[10-11]。迄今为止,关于在鹿茸发生和再生过程中,PI3K/AKT信号通路对鹿茸干细胞增殖、骨架、周期和促血管形成等的影响和调控还未见报道。
本研究以体外培养的AP细胞和PP细胞为对象,以体细胞FP细胞为参照,探究通过使用PI3K/AKT信号通路的抑制剂LY294002对3种细胞增殖、黏附、细胞周期、细胞骨架和促血管形成方面的影响,以揭示PI3K/AKT信号通路调节鹿茸器官发生和再生过程中对AP和PP细胞特性的影响及作用。
1 材料与方法 1.1 材料东北梅花鹿仔公鹿额外嵴的AP(图 1A和C)和FP组织,成年公鹿(3岁龄)PP组织(图 1B和D)采样,并对AP、PP和FP组织进行细胞原代培养,冻存备用[12]。本试验所用鹿茸细胞为第4代细胞,人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自吉林大学。DMEM(Life);FBS(Gibco);LY294002(碧云天);KU-0063794(Sigma);p-AKT(Ser473)抗体(Cell Signaling);羊抗兔IgG (Abcam), GAPDH抗体(Proteintech);HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgG(碧云天);细胞周期检测试剂盒(上海生工);低生长因子Matrigel(Life)。
AP、PP和FP细胞分别于培养液(DMEM+10% FBS)生长至80%左右,培养液换成DMEM继续培养12 h,然后分别于DMEM+1‰DMSO(对照组)和DMEM+LY294002(50 μmol·L-1)中培养3 h。根据磷酸化蛋白提取试剂盒(贝博)步骤提取磷酸化蛋白。以GAPDH为内参,Western blot方法相对定量p-AKT表达量,试验重复3次。数据经ImageJ 1.48软件统计分析。
1.3 细胞增殖检测AP、PP和FP细胞分别按照2.5×104·mL-1(1 mL·well-1)的密度在24孔板(NEST)中培养(DMEM+10%FBS)生长至40%左右,培养液换成DMEM继续培养12 h,3种细胞在DMEM+LY294002(终浓度分别为15、25、35和50 μmol·L-1)中分别培养12、24和48 h,并在每个LY294002浓度和时间点设立对照组(DMEM+1‰ DMSO),试验重复3次。按照MTT(60 μL·well-1)法处理[13],570 nm处检测OD值以检测3种细胞每个LY294002浓度和时间点的吸光度(optical density,OD)值。增殖抑制率(IR)=[1-OD(试验组)/OD(对照组)]×100%。数据统计利用SPSS 22软件进行单因子方差分析,结果以“平均值±标准误(x±sx)”表示。
1.4 细胞周期检测AP、PP和FP细胞分别在培养瓶(NEST)中培养(DMEM+10%FBS)生长至80%左右,更换成DMEM继续培养12 h,然后分别于DMEM+1‰DMSO(对照组)和DMEM+LY294002(50 μmol·L-1)培养12 h。根据细胞周期检测试剂盒(上海生工)说明书:胰酶消化,预冷的PBS清洗2次,75%乙醇固定(-20 ℃)过夜,收集细胞,用含有RNase的PBS悬浮并37 ℃孵育30 min,碘化丙啶(PI)黑暗情况下标记30 min。流式细胞仪(检测通道:FL2,CV≤8%,BD,美国)检测细胞周期中G0-G1、S和G2-M的比例。
1.5 细胞黏附检测AP、PP和FP细胞分别在培养瓶中培养(DMEM+10% FBS)生长至80%左右,培养液更换成DMEM继续培养12 h,然后分别在DMEM+1‰ DMSO(对照组),DMEM+LY294002(50 μmol·L-1)和DMEM+胰岛素(10-6 mol·L-1)培养12 h。收集细胞,按照3×104·cm-2密度接种至Matrigel(20 μL·well-1)预处理的96孔板,继续培养4 h,更换培养基(DMEM+ 20 μL MTT)继续培养4 h,PBS清洗两次,加入DMSO(150 μL·well-1),使用分光光度计570 nm处检测OD值。OD值越高代表黏附于Matrigel上的活细胞数量越多,细胞黏附性越强。采用T检验分析数据差异性。
1.6 细胞骨架染色AP、PP和FP细胞在盖玻片(NEST)上培养(DMEM+10% FBS)生长至50%左右,培养液更换成DMEM继续培养12 h,然后分别在DMEM+1‰ DMSO(对照组)和DMEM+LY294002(50 μmol·L-1)培养12 h。根据考马斯亮蓝R250染色方法[14]对细胞骨架进行染色:取出盖玻片,4%多聚甲醛固定5 s,1% Triton-X100处理30 min,4%多聚甲醛固定15 min,考马斯亮蓝R250染色40 min,二甲苯脱色10 min,每步操作之间用PBS清洗3次,每次5 min。光学显微镜拍照观察。
1.7 血管形成试验鹿茸发生和再生的细胞基础分别是AP和PP细胞,因此本试验比较了两种鹿茸干细胞促血管形成方面的作用。取AP和PP细胞于培养瓶中培养(DMEM+10%FBS)生长至70%左右,然后于DMEM培养12 h,每种细胞分别在DMEM+1‰DMSO(空白对照组)、DMEM+VEGF(20 μmol·L-1,阳性对照组)、DMEM+LY294002(50 μmol·L-1)和DMEM+KU-0063794(mTOR通路抑制剂,30 μmol·L-1)中培养24 h,收集上述培养液待用。96孔板用Matrigel(50 μL·well-1)37 ℃预处理1 h,接种HUVECs(2.5×104·well-1)并分别在上述收集的培养液中培养6 h。于光学显微镜(Thermo Fisher, USA)下采集血管形成图片,并利用ImageJ 1.48软件统计成管数量。
2 结果 2.1 p-AKT在AP、PP和FP细胞中的表达水平PI3K/AKT信号通路激活与否依赖于AKT的磷酸化水平[15],因此AKT磷酸化水平反映了PI3K/AKT信号通路在细胞中表达水平的高低。LY294002抑制PI3K/AKT信号通路后对AP、PP和FP细胞中p-AKT表达量影响明显,相对于空白对照组,PI3K/AKT信号通路被抑制以后,三种细胞的p-AKT表达水平都极显著降低(P < 0.01)(图 2)。p-AKT的表达量在AP细胞中最高,PP细胞中最低,且三种细胞之间表达量差异极显著(P < 0.01)。结果表明PI3K/AKT信号通路在AP细胞(PI3K/AKT信号通路被抑制以后,p-AKT表达量降低了50%左右)中作用更为明显。
为探究PI3K/AKT信号通路对鹿茸干细胞增殖的影响,本试验使用LY294002作为抑制剂检测了抑制PI3K/AKT信号通路后鹿茸干细胞的增殖抑制率。LY294002作用后AP、PP和FP细胞增殖被抑制(图 3),三种细胞的增殖抑制率对LY294002具有浓度依赖性(表 1),但培养时间只对AP细胞增殖有极显著影响(P < 0.000 1)。结果表明PI3K/AKT信号通路是调节AP细胞增殖的主要通路,随着培养时间增加,FP和PP细胞在增殖方面对PI3K/AKT信号通路依赖性降低。
AP、PP和FP细胞的周期变化如图 4所示。
AP、PP和FP的绝大部分细胞都处于G0-G1期,在G2-M期没有明显的细胞积累。相对于对照组,经LY294002处理后AP、PP和FP细胞处于G0-G1、S和G2-M期的比例差异不显著(P>0.05)。结果显示抑制PI3K/AKT信号通路对AP、PP和FP细胞周期无影响。
2.4 LY294002对AP、PP和FP细胞黏附的影响胰岛素[16]以及上调PI3K/AKT[17]都可以增加细胞黏附性。因此本试验用LY294002处理鹿茸干细胞,检测PI3K/AKT信号通路对细胞黏附性的影响,胰岛素处理组作为阳性对照组。结果(表 2)显示:鹿茸干细胞经LY294002和胰岛素处理,细胞黏附性极显著升高(P < 0.01);FP细胞经LY294002处理后,细胞黏附性无显著变化(P>0.05),经胰岛素处理后细胞黏附性极显著升高(P < 0.01)。该试验结果表明抑制PI3K/AKT信号通路能够提高鹿茸干细胞的黏附性,但对正常体细胞无显著影响。
AP、PP和FP细胞骨架如图 5所示。本试验中细胞经过Triton-X100处理后微管会消失,试验中观察到的主要是微丝[18]。AP细胞(图 5第2行左图)经LY294002处理后细胞形状和细胞微丝完全被破坏。PP细胞(图 5第2行中间图)经LY294002处理后细胞形状基本没有变化,但是细胞微丝的合成量明显降低。FP细胞(图 5第2行右图)经LY294002处理以后细胞形状有一定程度的破坏,但细胞微丝的合成量没有太大的变化。结果显示PI3K/AKT通路被抑制以后对AP细胞的形状和细胞骨架合成量影响最为明显。
鹿茸发生和再生过程中需要血管提供大量的营养物质。AP和PP细胞血管形成试验如图 6所示。AP细胞的条件培养液(图 6B1)相对于空白对照组(图 6A1)成管腔数量有极显著差异(P < 0.01),与阳性对照组(图 6A3)差异不显著(P>0.05)。相对于空白对照组,PP细胞的条件培养液(图 6A2)对成管腔数量无显著变化(P>0.05)。AP细胞经LY294002(图 6B2)和KU-0063794(图 6B3)抑制后成管腔数量极显著降低(P < 0.01)。结果表明PP细胞没有明显促血管形成的作用,AP细胞具有明显的促血管形成作用。
为探究PI3K/AKT信号通路在鹿茸发生和再生过程中的作用,笔者通过LY294002抑制PI3K/AKT信号通路研究PI3K/AKT信号通路对鹿茸干细胞增殖、周期、骨架、黏附和促血管形成作用的影响。PI3K包括两个亚基:调节亚基P85和催化亚基P110;P110亚基能够催化PIP2为PIP3,进而AKT被PIP3催化激活形成活性状态的p-AKT[19]。LY294002能通过抑制PI3K催化亚基P110的活性来阻断AKT的激活途径。本研究中AP细胞中p-AKT的表达量极显著高于FP和PP细胞中的表达量(P < 0.01),表明PI3K/AKT信号通路在AP细胞中作用显著,此结果与PI3K/AKT信号通路在AP细胞中显著表达一致[9]。然而,PP细胞作为鹿茸再生的基础,其p-AKT表达量不仅极显著低于AP细胞(P < 0.01),而且极显著低于FP细胞中的表达量(P < 0.01),其机制有待进一步的研究。
前期的研究发现AP组织中大约500万个细胞参与了鹿茸发生过程;每年参与鹿茸再生的PP细胞也只有300万个,却能在短短60 d内长出10 kg的鹿茸组织[1],这些参数表明AP和PP细胞具有快速增殖和自我更新的潜能。本试验结果显示PI3K/AKT信号通路在调节AP和PP细胞增殖的过程中均发挥着重要作用。数据统计分析(表 1)可知:AP细胞在不同培养时间和LY294002浓度影响下,增殖被显著抑制(P < 0.000 1),表明PI3K/AKT信号通路是调节AP细胞增殖的关键通路;PP细胞增殖与LY294002浓度极显著相关(P < 0.000 1),与培养时间不显著相关(P=0.075),表明随着培养时间的增加,即使PI3K/AKT通路被抑制,其他调节细胞增殖的通路或许也参与调控细胞增殖,用以补偿PI3K/AKT通路被抑制后对细胞增殖的负面影响。前期的研究发现在PP细胞中发挥显著调控作用的ERK/MAPK信号通路也是调节细胞增殖的重要通路之一[9, 20],因此,有可能是后者发挥了作用。
细胞骨架包括微丝、微管和中等纤维[21-22]。本试验中细胞经过Triton-X100处理后微管会消失,试验中观察到的主要是微丝[18]。微丝的合成和重组与细胞形状的维持密不可分[2-24]。研究表明,细胞骨架的损害先于细胞形态结构的损伤[25]。本试验结果显示:相对于PP细胞,AP细胞形状改变更明显,说明PI3K/AKT信号通路对AP细胞微丝的合成和重组影响更大。C. Li等[8]分析发现AP细胞中PI3K/AKT信号通路作用最为显著(P < 0.001),PP细胞中actin cytoskeleton signalling和MAPK信号通路作用最为显著(P < 0.001)。而且与微丝合成和重组有关的信号通路还包括actin cytoskeleton signaling、Fak、Src、MAPK和Rho GTPases[26-31]。因此PI3K/AKT信号通路在调节AP细胞微丝的合成和重组中起主要作用,PP细胞中或许主要是actin cytoskeleton signalling和MAPK信号通路参与微丝的合成和重组。
鹿茸发生初期,AP细胞快速增殖分化需要新生大量血管以满足鹿茸快速发生的营养供给。血管造影法显示,鹿茸的动脉来源于鹿头部颞浅动脉的分支[32]。体内研究证实异位移植的AP具有强烈的刺激血管形成的能力以维持AP的存活与发育[33]。这就不难理解体外培养的AP细胞为什么具有极强促成管能力(图 6B1)。鹿茸再生时,角柄中已经存在的大量动脉,理论上可以认为这些血管可以为PP细胞的快速增殖和分化提供充足的营养,PP细胞可能也就不需要具有促成管的能力。异位移植的PP虽然能够在异位存活,但是不能形成异位鹿茸,可能与其刺激血管形成的能力有关[33]。本研究从体外试验角度证实了上述推测,两者在异位生茸能力上差异的主要原因之一在于AP具有强烈的刺激血管形成的能力,而PP没有。AP细胞经LY294002(图 6B2)和KU-0063794(图 6B3)处理失去促血管形成作用,结果初步表明PI3K/AKT/mTOR信号通路是调控鹿茸发生过程促血管形成的关键信号通路。
AP和PP细胞作为鹿茸发生和再生的细胞基础,本文首次研究了抑制PI3K/AKT信号通路对两种干细胞的影响。研究结果显示相对于PP细胞,PI3K/AKT信号通路在调节AP细胞增殖、维持正常的细胞骨架和促血管形成方面发挥较为重要的作用,即相对于鹿茸再生,在鹿茸发生过程中PI3K/AKT信号通路起着较为重要的调控作用。试验结果初步表明PI3K/AKT及其下游的mTOR信号通路是调控AP细胞促血管形成作用的关键通路。本试验可为研究鹿茸甚至是人体器官的发生和再生机制提供借鉴。
4 结论相对于鹿茸再生,PI3K/AKT信号通路在鹿茸发生过程中的调控作用更为重要。PI3K/AKT及其下游的mTOR信号通路是调控AP细胞促血管形成作用的关键通路。
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