禽呼肠孤病毒(avian reovirus, ARV)是重要的禽病病原体之一,临床上主要引起矮小综合征、病毒性关节炎/腱鞘炎、免疫抑制和吸收不良综合征等。ARV感染导致鸡群生长缓慢,生产性能下降,免疫抑制,从而导致疫苗免疫失败,易继发或并发其他病原体感染,给养禽业造成巨大的经济损失[1-2]。
病原与宿主相互作用的动态过程是病原与宿主为了自身生存而相互博弈的过程,决定和影响病原引发疾病的发生、发展和预后[3-4]。转录组学是在整体水平上研究细胞中基因表达情况及调控规律,能够提供全部基因的表达调控和蛋白质的功能及其相互作用的信息。近年来,RNA-seq转录组学技术迅猛发展,在动物病原体的致病机制研究中得到了广泛应用,极大地推动了病原微生物相关研究的进展。杭柏林利用基因芯片技术分析了ALV-J JS09GY3株感染SPF鸡后,法氏囊的基因表达情况,检测出在法氏囊中有594个差异表达基因,这些差异表达基因涉及细胞过程、结合、生物学调节、代谢加工、刺激反应和免疫系统等反应,主要参与了细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路、RIG-I-like受体信号通路等,为更好地理解ALV-J感染的分子机制提供了理论基础[5]。P.Y.Lin等利用基因芯片技术,分析ARV S1133感染细胞和ARV σC蛋白转染细胞的基因表达谱,发现许多DNA损伤和细胞凋亡相关基因上调表达,但是只有DDIT-3和GADD45α在两者都是表达上调,表明ARV S1133能够诱导细胞发生DNA损伤,并且这一过程需要中间调控分子ROS以及DDIT-3和GADD45α参与的信号通路[6]。ARV S1133是禽呼肠孤病毒的标准毒株,可以引起鸡出现典型的关节肿胀症状和免疫抑制;而ARV aS1133是ARV S1133经鸡胚长期减毒弱化形成的弱毒疫苗株,可作为疫苗接种鸡群,诱导免疫应答,保护鸡群抵抗强毒株攻击。本研究旨在利用RNA-seq高通量测序技术进行ARV强毒株和弱毒疫苗株感染易感细胞——LMH细胞的早期转录组学分析,从细胞基因转录水平上对ARV不同毒力毒株入侵宿主机制的差异以及宿主的不同防御机制进行分析,以揭示ARV与宿主之间相互作用的分子机制,有助于进一步理解ARV感染的致病机制。
1 材料与方法 1.1 主要仪器和试剂罗氏Lightcycle2.0荧光定量PCR仪购自Roche公司,RNA抽取试剂TRIzol LS Reagent购自Invitrogen公司;反转录酶、dNTP、SYBR® Premix Ex TapTM Ⅱ购自TaKaRa公司。
1.2 细胞培养和病毒感染LMH细胞生长在含10%胎牛血清、45% F-12的DMEM培养液中,在37 ℃含5% CO2的培养箱中培养。铺在6孔培养板中,调整细胞密度为2×106·孔-1,培养至单层。根据预试验结果,分别接种1 MOI的ARV S1133和ARV aS1133病毒液,连续培养2、6、12 24、48、60和72 h,每个滴度设3个重复,设置ARV S1133感染组、ARV aS1133感染组和未感染对照组。在感染后6、12和24 h时间点,收集细胞,3 000 r·min-1离心5 min,弃去上清,用无菌PBS洗涤1次后,-70 ℃保存待用。
1.3 RNA样品的制备按照Invitrogen公司的TRIzol试剂使用说明书,制备总RNA样品。参照宝生物工程(大连)有限公司的DNase Ⅰ(RNase Free)说明书,利用DNase Ⅰ(RNase Free)消除RNA样品中的残留基因组DNA。除去基因组DNA后,采用德国Macherey-Nagel公司的RNA纯化试剂盒进行RNA样品的纯化和回收。用超微量核酸蛋白分析仪(NanoDrop-1000)检测RNA浓度(μg·mL-1)和纯度(OD260 nm/OD280 nm)。
1.4 Illumina高通量RNA-Seq测序和数据分析由深圳华大基因研究院提供技术服务,使用Illumina HiSeqTM 2000进行测序。对测序结果进行序列比对,确定序列基因,利用生物信息学分析平台进行差异基因的表达模式聚类分析、GO功能注释分析和pathway显著性富集分析等。
1.5 荧光定量RT-PCR方法验证差异基因的转录水平随机挑选出部分差异基因,根据其在GenBank上发表的保守核苷酸序列,设计特异引物(表 1),建立荧光定量RT-PCR方法,检测RNA样品中的差异基因的转录水平。以GAPDH为内参基因,利用2-ΔΔCt法计算差异基因的相对表达量,每个样品做三个重复。反应体系为:10.0 μL SYBR Premix,2.0 μL模板,2.0 μL上、下游引物,dH2O补足20.0 μL。反应程序为:95 ℃预变性10 s;95 ℃变性10 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s,40个循环。反应结束后进行熔解曲线分析,程序:95 ℃ 0 s,65 ℃ 20 s,95 ℃ 0 s 0.1 ℃·s -1。
图 1显示ARV S1133和aS1133感染后不同时间点的细胞病变,ARV S1133和aS1133均可以诱导LMH细胞出现病变,感染初期细胞变圆,随着感染时间的推移,细胞出现典型的空泡病变,然后细胞萎缩,脱落,死亡,两者诱导的细胞病变没有明显差别。根据上述结果,为了分析ARV不同毒力毒株早期感染LMH细胞后的基因转录变化,选取病毒接种剂量1 MOI,感染后6、12和24 h的感染细胞,作为研究对象,进行ARV感染早期的转录组学分析。
为了比较ARV不同毒力毒株感染LMH细胞后的基因转录表达变化,将ARV强毒株S1133和弱毒疫苗株aS1133以1 MOI为感染剂量分别感染LMH细胞,感染后6、12和24 h,收集感染细胞和未感染细胞,制备RNA样品,送去华大深圳基因研究院进行RNA-seq测序,并选择上下调倍数≥2且P≤0.001的差异基因进行分析。结果显示,ARV S1133感染组和ARV aS1133感染组相比,在6 hpi,58个差异基因上调,5个差异基因下调;在12 hpi,有1 429个差异基因上调,354个差异基因下调;在24 hpi,有1 680个差异基因上调,481个差异基因下调。上调、下调表达最显著的部分差异基因具体见表 2~7。
如图 2所示,对这些差异基因作进一步分析,发现15个基因在6和12 hpi表达显著差异,6和24 hpi有5个共同基因,而12和24 hpi则有489个共同差异基因。
为了了解差异基因的表达模式,使用MeV对这些差异基因的表达模式聚类进行z-score共表达趋势分析(图 3),分析结果显示这些差异表达基因根据其表达模式,可以分为10种共表达趋势。
为了获知ARV不同毒力毒株感染LMH细胞后的基因表达变化引起的功能性改变,利用DAVID在线软件,对筛选出的差异基因进行GO功能分析,预测和注释差异基因的分子功能和参与的生物过程。图 4分别是ARV感染后6、12和24 h时,差异基因具有的显著性最高的前10种分子功能,涉及细胞因子、蛋白络氨酸∕丝氨酸∕苏氨酸磷酸酶、受体结合、转录因子结合、核苷三磷酸酶调节、GTP酶调节、小GTP酶调节、分子转导、信号转导、蛋白激酶等生物功能。从富集分析结果可以看出,与ARV aS1133感染相比,S1133的感染增强了宿主细胞的蛋白络氨酸∕丝氨酸∕苏氨酸磷酸酶、核苷三磷酸酶调节、GTP酶调节、小GTP酶、蛋白激酶等的活性,促进细胞因子活性,提高受体、转录因子的结合能力,表明ARV S1133的感染对宿主细胞的活性、代谢等产生明显的影响。
图 5列出差异基因在3个感染时间点可能参与的生物过程,主要是机体应激、免疫应答、信号传导、细胞连接和生物调控等,分析结果提示酶、DNA分子、转录因子、信号分子等的活性相关基因发生显著性变化,引起细胞对病毒感染的应激,产生免疫应答等,说明感染后细胞的正常生理功能受到显著性影响,这是细胞受到病毒侵害后基因的被动应答表现。
利用DAVID软件,对差异基因的通路进行富集分析。表 8列出了不同感染时间点差异基因可能参与的显著性最高的10个通路,如Toll-like信号通路、TGF-β信号通路和黏附连接等。这些信号通路分析结果表明,ARV不同毒力毒株感染LMH细胞后,宿主细胞原有的正常代谢机制也随之发生不同改变,尤其与细胞受体、细胞凋亡、细胞联系、脂肪合成等相关信号通路的调控受到干扰和影响,以致维持细胞正常生长、信号传递等生命活动的信号通路出现异常调控,最终造成ARV不同毒力毒株的感染对宿主造成不同的损伤。
为了验证转录组学测序的结果,随机挑选相关差异表达基因,用荧光定量RT-PCR方法检测差异基因在整个感染过程中的转录变化。如图 6所示,荧光定量RT-PCR数据表明验证结果和转录组学测序结果基本一致。
基于高通量测序平台的转录组学研究技术的快速发展为在全基因组转录水平检测差异基因的表达、结构和功能提供了研究可能。在本研究中,利用RNA-seq技术,并借助GO和KEGG数据库等生物信息学分析平台,分析和比对ARV强毒株S1133和弱毒疫苗株aS1133感染宿主细胞后的表达差异基因,获得了大量的有价值信息。研究结果显示,ARV S1133和aS1133分别感染后,宿主细胞的代谢、转录合成等正常生理活动调控发生不同的显著性变化,说明ARV感染破坏了宿主细胞原有的生理调控平衡,而宿主细胞针对不同毒力毒株的感染,也作出不同的应答对抗,这可能是ARV能够侵入宿主,并产生致病的根本原因。
病毒和宿主之间的博弈决定了病毒感染致病的进程和结果,因此,通过分析病毒和宿主之间的相互作用,也就可以解析病毒感染致病的机制。通过宿主细胞感染ARV不同毒力毒株后差异表达基因的GO功能和Pathway富集分析,发现ARV S1133感染引起LMH细胞的基因表达和信号通路显著变化,从而细胞的生理功能改变,在病毒感染致病和宿主免疫应答方面发挥着重要作用。由分析结果可以看出感染前期,相比较于aS1133毒株, 宿主细胞为了应对S1133的感染,迅速而显著性地启动天然免疫相关信号通路,产生相应的细胞因子等,建立抗病毒效应,对抗ARV感染。天然免疫系统是机体抵御病原微生物感染和有害物质侵害的第一道防线。病原体入侵后,宿主细胞通过识别特定的模式识别受体,识别不同类型的病原体相关分子模式,进而激发一系列信号通路,建立宿主的天然免疫反应,以应对病原体的入侵。Toll样受体信号通路是目前研究最多的受体通路,通过MyD88依赖型或MyD88非依赖型途径,招募下游相关受体激酶,激活通路,诱导机体产生大量的Ⅰ型干扰素和一系列促炎性细胞因子[7]。竭航研究马立克病病毒感染对鸡淋巴器官中Toll样受体基因及其下游基因的表达影响,发现TLR3、TLR7和TLR15在感染早期表达上调,参与到抗马立克病病毒感染,但是感染后期,马立克病病毒引起的器官转瘤反应抑制了TLRs的表达[8]。本研究团队在ARV感染的鸡胚成纤维细胞中,检测到高水平的TLR3、TLR7、TLR5、TLR15和TLR21等受体,提示ARV感染可以激活Toll样受体信号通路,从另一角度也验证了转录组学结果的正确性[9]。此外,笔者通过检测ARV感染的外周血中相关免疫基因的表达变化,证实了ARV可以调控宿主的天然免疫应答[10]。
相对应地,为了突破宿主的防御体系,病毒发展出许多应对策略来破坏宿主的抗病毒防线。研究表明ARV的感染可诱导一系列细胞反应,包括细胞凋亡、炎症反应、细胞融合、细胞形态改变乃至降解以及细胞周期停滞等[6, 11-13]。H. Y. Lin等证明ARV在感染早期,通过诱导细胞凋亡,以实现病毒的入侵和感染,并且ARV诱导的机体组织损伤可能和细胞凋亡有关[14]。在对ARV不同毒株感染LMH细胞后差异表达基因的比对分析中,笔者发现ARV强毒株可以上调PI3K、NF-κB、MAPK等的表达,这些基因都与细胞凋亡相关。本研究团队已证实了ARV σA蛋白能够激活PI3K/Akt信号通路,上调表达磷酸化的Akt,从而抑制细胞凋亡的发生,以利于ARV在宿主细胞内的感染复制[15];并且σA蛋白可能通过与其他宿主细胞蛋白,而不是与PI3K的p85调节亚基直接结合,来实现对PI3K/Akt信号通路的调控[16-17]。这个结果也与ARV感染的转录组学分析结果相一致。此外,转录组学分析结果还提示ARV S1133感染可激活TGF-β信号通路,而现有研究表明TGF-β可作用MAPK、NF-κB和Akt通路等,参与和介导细胞凋亡[15]。因此,ARV S1133可能通过对TGF-β信号转导通路的调控,改变宿主细胞内环境,使之适应和利于自身的侵入和增殖,具体机制尚未清楚,需要在以后研究中进行探讨。
4 结论通过对ARV S1133感染组和aS1133感染组的转录组数据进行比对分析,发现ARV强毒株与弱毒疫苗株感染后LMH细胞转录组的应答差别,获得感染后6、12和24 h的差异表达基因,并进行研究。GO功能注释和分析结果表明差异基因主要具有GTP酶调节活性、信号转导活性、蛋白激酶活性等生物功能;主要参与机体应激、细胞信号转导、细胞凋亡等生物过程。Pathway富集分析结果表明差异表达基因主要参与Toll样受体信号通路、TGF-β信号通路、病原体感染应答等细胞信号通路。
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