畜牧兽医学报  2017, Vol. 48 Issue (11): 2091-2097. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2017.11.010    PDF    
小尾寒羊黄体期和卵泡期生殖轴凋亡基因的表达研究及其与发情的关系
曹晓涵1,2#, 刘秋月1#, 王翔宇1, 狄冉1, 胡文萍1, 张效生3, 张金龙3, 曾宪垠2, 储明星1     
1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室, 北京 100193;
2. 四川农业大学生命科学学院, 雅安 625014;
3. 天津市畜牧兽医研究所, 天津 300381
摘要:旨在分析BadBaxBcl-2和Bcl-xL基因在小尾寒羊黄体期和卵泡期下丘脑-垂体-性腺轴各组织中的表达差异,并探究这些基因与绵羊常年发情性状的关系。以常年发情小尾寒羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术,对比分析了BadBaxBcl-2和Bcl-xL 4个基因在不同繁殖状态下(黄体期和卵泡期)小尾寒羊下丘脑-垂体-性腺轴各组织中的表达特征,采用放射免疫法(RIA)检测相应时期血清雌二醇和孕酮含量。结果表明,BadBaxBcl-2和Bcl-xL 4个基因在下丘脑、垂体、卵巢均有表达,BadBcl-2在黄体期的垂体和卵巢中的表达量均显著高于卵泡期(P < 0.05),在下丘脑中2个时期表达量都没有显著差异(P>0.05);BaxBcl-xL在黄体期下丘脑、垂体和卵巢中的表达量与卵泡期均无显著差异(P>0.05)。黄体期血清中孕酮含量显著高于卵泡期(P < 0.05),而2个时期血清中雌二醇含量没有显著差异(P>0.05)。BadBcl-2基因在小尾寒羊黄体期和卵泡期的垂体和卵巢中差异表达,可能参与调控黄体期到卵泡期的发情状态转换,从而启动小尾寒羊发情。
关键词绵羊    凋亡相关基因    生殖轴    组织表达    发情    
Expression Levels of Apoptotic Genes in HPG Axis during Luteal and Follicular Periods and Their Association with Estrus in Small Tail Han Sheep
CAO Xiao-han1,2#, LIU Qiu-yue1#, WANG Xiang-yu1, DI Ran1, HU Wen-ping1, ZHANG Xiao-sheng3, ZHANG Jin-long3, ZENG Xian-yin2, CHU Ming-xing1     
1. Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
2. College of Life Science, Sichuan Agricultural University, Ya'an 625014, China;
3. Tianjin Institute of Animal Sciences, Tianjin 300381, China
Abstract: In order to identify the differential expression levels of Bad, Bax, Bcl-2 and Bcl-xL in hypothalamus-pituitary-gonadal (HPG) axis tissues during luteal and follicular periods, and to study the association of these genes with year-round estrus in Small Tail Han sheep. Year-round estrous Small Tail Han ewes were selected as tested subjects, and real-time PCR method was used to detect Bad, Bax, Bcl-2 and Bcl-xL mRNA expression by using 18S RNA as reference gene in hypothalamus-pituitary-gonadal axis tissues during luteal and follicular periods. The serum estradiol and progesterone contents were measured by RIA at the corresponding time points. The results showed that Bad, Bax, Bcl-2 and Bcl-xL genes were all expressed in hypothalamus, pituitary and ovary tissues. The expression levels of Bad and Bcl-2 genes in pituitary and ovary tissues in the luteal phase were higher than those in the follicular phase (P < 0.05). The expression levels of Bad and Bcl-2 genes in hypothalamus had no significant differences between the luteal phase and the follicular phase (P>0.05). The expression levels of Bax and Bcl-xL genes in hypothalamus, pituitary and ovary tissues had no significant differences between the luteal phase and the follicular phase (P>0.05). The concentration of progesterone in the luteal phase was significantly higher than that in the follicular phase (P < 0.05), while the estradiol concentration had no significant difference between the 2 stages (P>0.05). The results indicated that the expression levels of Bad and Bcl-2 genes had great differences during the luteal and follicular periods of Small Tail Han sheep, which might regulate the stage transition from luteal to follicular periods, and the 2 genes were associated with estrus onset in Small Tail Han sheep.
Key words: sheep     apoptosis-related genes     reproductive axis     tissue expression     estrus    

大多数绵羊为季节性发情动物,但季节性发情的分子机制目前尚不明晰。近年研究发现细胞凋亡与发情有密切关系。而细胞凋亡主要由Bcl-2家族的凋亡相关基因(BadBaxBcl-2和Bcl-xL)调控。绵羊季节性发情的特点严重影响了其生产能力。其发情调控受到多种因素的影响,而Bad基因(Bcl-2 associated agonist of cell death gene,与Bcl-2相关的促凋亡基因)可能是影响发情启动的调节因素之一。Bad是第一个被发现的与卵泡闭锁相关的促凋亡因子[1],属于Bcl-2家族。Bcl-2家族成员包括抑制凋亡(促生存)的Bcl-2(B-cell lymphoma-2,B淋巴细胞瘤-2)、Bcl-xL(Bcl2样因子1,Bcl2-like 1或Bcl2l1),多结构域促凋亡的Bax(与Bcl2相关的促凋亡调节因子X,Bcl2 associated X, apoptosis regulator)以及仅含BH-3结构域的Bad成员等[2-3],它们对雌性和雄性生殖细胞的凋亡都起到重要作用[4]Bad基因与以上家族成员相互作用,调节黄体的形成与退化,从而影响生殖激素分泌,参与发情启动过程。Bcl-2家族蛋白介导的细胞凋亡对雌性动物的卵泡闭锁起重要作用,而卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡有密切关系。目前,关于凋亡相关基因在绵羊组织表达图谱的研究还不多,少量的研究主要集中在外环境刺激后相关基因mRNA表达量变化[5]。关于小尾寒羊四季发情性状调控的分子机理,尤其是生殖轴各组织表达规律的研究鲜有报道。本研究选取常年发情的小尾寒羊为研究对象,分别采集黄体期和卵泡期的下丘脑-垂体-卵巢这一生殖调控轴上的3个组织以及血液,采用荧光定量PCR方法检测促凋亡基因BadBax和抑制凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL在各组织中的表达特征;采用放射免疫方法检测血清孕酮(Progesterone,P4)和雌二醇(Estradiol,E2)的含量,比较小尾寒羊不同繁殖状态下基因表达和激素含量的差异,初步分析细胞凋亡调控与发情状态的关系,为进一步揭示小尾寒羊常年发情的分子机理奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验动物与样品采集

小尾寒羊饲养于天津市畜牧兽医研究所试验羊场,正常饲喂,自由饮水。适应性饲养两周后进行试验。选取身体健康、营养状况良好、体重一致的小尾寒羊母羊6只,放置阴道孕酮栓(CIDR),同时注射5 mL维生素AD以保护阴道内膜。12 d后撤栓,撤栓当天记为1 d,撤栓时刻记为0 h。撤栓后使用腹腔镜观察卵泡发育和排卵情况以确定卵泡期采样时间;使用公羊试情以确定发情时间。连续进行两个情期,确定在撤栓后45 h(卵泡期)和10 d(黄体期)屠宰采样,每组各3只(n=3)。

屠宰前颈静脉采血,离心,血清存于-20 ℃备用。屠宰后立即取下丘脑、垂体和卵巢3个组织,用锡箔纸包好迅速投入液氮速冻,带回实验室后转入-80 ℃保存备用。

1.2 试剂与仪器 1.2.1 主要试剂(盒)

RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司,北京),反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT Reagent Kit,TaKaRa,大连),荧光定量染料(Kapa SYBR® FAST qPCR Kit Master Mix,Kapa Biosystems,USA),EP管、八联管、枪头等耗材均为RNase free产品。

1.2.2 主要仪器

凝胶成像系统(ChemiDocTM XRS+,BIO-RAD,USA),Nano Drop2000微量分光光度计(Nano Drop Technologies,USA),荧光定量PCR系统(Roche Light CyclerTM 480 Ⅱ real-time PCR system,Roche, USA)。

1.3 总RNA提取及cDNA第一链的合成

采集的小尾寒羊各组织总RNA提取按照试剂盒说明进行,用1.0%琼脂糖凝胶电泳和Nanp Drop 2000检测提取RNA的质量和浓度。使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit反转录合成cDNA第一链,按照说明书操作要求,反应体系为1 μg RNA,总体积20 μL,程序为37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,反转录的cDNA第一链-20 ℃保存备用。

1.4 荧光定量引物设计及目的基因表达量检测

根据GenBank中绵羊Bad基因序列(XM_004019650.3),用Primer3.0在线软件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计引物;根据文献中已报道的绵羊Bax[6]Bcl-2[6]Bcl-xL[7]和18S[8]基因序列合成引物,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列和产物大小见表 1

表 1 绵羊BadBaxBcl-2、Bcl-xL和18S基因的引物序列和产物大小 Table 1 Primer sequence and product size of ovine Bad, Bax, Bcl-2, Bcl-xL and 18S genes

采用Real-time PCR技术,以各组织cDNA为模板,定量检测目的基因BadBaxBcl-2、Bcl-xL在卵泡期和黄体期小尾寒羊各组织中的相对表达量,比较这些基因在不同发情状态下的表达差异。反应体系:cDNA模板2 μL,2×KAPA染料Buffer 10 μL,上下游引物各0.4 μL,ddH2O补足20 μL。每孔3个重复。反应条件:95 ℃预变性10 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 10 s,40个循环。扩增反应结束后进行熔解曲线分析。

1.5 激素测定

将离心得到的血清送至北京北方生物技术研究所,使用RIA放射免疫激素检测试剂盒检测血清P4和E2含量。

1.6 数据分析

采用Excel进行数据处理,利用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量,使用SPSS Statistics 24软件ANOVA分析比较基因表达量差异,P < 0.05表示差异显著。

2 结果 2.1 总RNA的质量检测和Real-time PCR熔解曲线

取RNA 2 μL点样,以1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和浓度。检测结果如图 1所示,提取各组织的总RNA质量良好,无降解,28S和18S条带清晰明亮,且28S条带亮度大于18S,5S处无特异条带。OD260 nm/OD280 nm为1.8~2.0,RNA质量合格,符合后续进行Real-time PCR的要求。

图 1 3个组织RNA电泳结果 Figure 1 RNA electrophoretogram of the 3 tissues

本研究以18S为内参基因,BadBaxBcl-2、Bcl-xL为目的基因,各阳性样品模板在反应后期可得单峰、峰型锐利的熔解曲线,引物特异性良好,符合荧光定量PCR数据分析的要求。

2.2 BadBaxBcl-2、Bcl-xL基因在卵泡期和黄体期小尾寒羊下丘脑-垂体-性腺轴组织中的表达

通过Real-time PCR检测凋亡相关基因BadBaxBcl-2、Bcl-xL在小尾寒羊卵泡期和黄体期下丘脑、垂体和卵巢组织中的表达情况(图 2)。结果显示,这4个凋亡相关基因在下丘脑、垂体、卵巢组织中均有表达,在不同的组织表达规律不同。Bad在黄体期的垂体和卵巢组织的表达量显著高于卵泡期(P < 0.05),在下丘脑组织中2个时期表达量没有显著差异(P>0.05)。Bax在黄体期下丘脑、垂体和卵巢组织的表达量与卵泡期均无显著差异(P>0.05);无论在黄体期还是卵泡期,Bax基因的表达量均呈现卵巢>垂体>下丘脑的规律。基因Bcl-2表现出与Bad基因同样的规律,即黄体期的垂体和卵巢组织的表达量显著高于卵泡期(P < 0.05),但在下丘脑组织中2个时期表达量没有显著差异(P>0.05)。Bcl-xL基因在黄体期和卵泡期各组织中的表达量均无显著差异(P>0.05);无论在黄体期还是卵泡期,Bcl-xL基因的表达规律与Bax相反,呈现下丘脑>垂体>卵巢的规律。可见,在小尾寒羊不同繁殖状态下,这4个凋亡相关基因表达量的主要差异存在于垂体和卵巢,在上游中枢下丘脑组织无显著差异。

同一个组织不同时期比较,*.P < 0.05 Compared with the same organization at different periods, *.P < 0.05 图 2 BadBaxBcl-2、Bcl-xL基因在小尾寒羊卵泡期和黄体期下丘脑、垂体、卵巢的表达情况 Figure 2 Relative expression of Bad, Bax, Bcl-2 and Bcl-xL genes in follicular and luteal phases in hypothalamus, pituitary, ovary of Small Tail Han sheep
2.3 卵泡期和黄体期小尾寒羊生殖相关激素变化情况

使用RIA方法检测血清中P4和E2含量,结果如图 3所示。P4在黄体期和卵泡期的浓度分别为(0.173±0.017)和(0.070±0.005)ng·mL-1,E2在黄体期和卵泡期的浓度分别为(8.025±2.965)和(13.277±3.900)pg·mL-1,黄体期P4含量显著高于卵泡期(P < 0.05),而E2含量在2个时期没有显著差异(P>0.05)。

图 3 小尾寒羊卵泡期和黄体期的血清中孕酮和雌二醇含量 Figure 3 Progesterone and estradiol levels in the follicular phase and luteal phase of Small Tail Han sheep
3 讨论

发情是指雌性动物初情期后,受下丘脑-垂体-卵巢轴系调控的卵泡发育并分泌雌激素,雌激素进而作用于大脑皮质使雌性动物在生理和行为上发生变化的一种生理现象[9-10]。在动物的发情周期中,整个机体特别是生殖器官会出现一系列的形态和机能的变化。在小鼠[11]、猪[12]和狗[13]的研究表明,这些变化与细胞凋亡密切相关。生殖细胞的凋亡是繁殖过程中正常发育的一部分,生殖细胞在这些生物体中的死亡是一个创造性而不是破坏性的过程。尤其在卵子发生和排卵过程中细胞凋亡是重要环节[14],这一过程中许多不合格的生殖细胞被清除,同时产生了发育良好的卵母细胞[15]

细胞凋亡存在两种调控途径:死亡受体介导的“外源性凋亡通路”和线粒体介导的“内源性凋亡通路”。其中,线粒体内源凋亡通路发生在卵母细胞颗粒细胞,在细胞凋亡过程中占主导地位[16]。这个过程是由Bcl-2蛋白家族介导的。而卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡有密切关系。影响颗粒细胞凋亡的因素主要有两大类:内在的促凋亡或抗凋亡因子的调控以及外在的凋亡诱发因素(如激素刺激等)。

Bcl-2原癌基因是与细胞凋亡关系极为密切的基因之一,它能阻断引起细胞凋亡的最后通路,起到保护细胞的作用;Bcl-2的表达还可以缓解由外伤引起的神经细胞凋亡[17],而Bcl-2家族的成员Bax则具有对抗Bcl-2的作用,可促进细胞的凋亡[18]。在本研究中,BaxBcl-2在卵巢中的表达量刚好呈现相反的特征,与这一研究成果相符,说明在发情和不发情这2个不同生理状态下,细胞凋亡是重要的参与者,可能参与了发情状态的转换过程。基因敲除法研究证明,Bax能引起卵泡发生闭锁,若敲除Bax,卵泡数量增加[19],说明生殖细胞凋亡受到抑制;另有研究表明,在敲除Bcl-2的小鼠体内,初级卵泡数量减少[20],若Bcl-2过度表达,可导致出生后小鼠体内卵泡数目增加[21],说明Bcl-2有促进细胞存活作用。本研究出现相类似的规律:Bax的表达量在两个时期的卵巢中没有显著性差异,但可以看出卵泡期有高于黄体期的趋势;Bcl-2的表达量在黄体期显著高于卵泡期(P < 0.05)。由于Bad的促凋亡作用依赖于与Bcl-2或Bcl-xl结合[22],其中Bax和Bcl-2的比值是细胞的“凋亡开关”,二者的平衡决定了卵泡发育或是闭锁[23]。黄体期Bcl-2/Bax比值高于卵泡期,而Bcl-2/Bax比值高时,形成Bcl-2/Bax异源二聚体,抑制凋亡;Bcl-2/Bax比值低时,或者当Bcl-2/Bax之间的作用被破坏时,形成Bax/Bax同源二聚体,诱导凋亡[24]。而卵泡期正是卵泡经历发育-募集-凋亡-优势卵泡成熟的时期,这一系列生理活动伴随着颗粒细胞凋亡引起的非优势卵泡闭锁。所以在卵泡期Bcl-2/Bax比值是低于黄体期的。而V.Praveen Chakravarthi等[6]的研究发现,体内生长和体外培养的卵巢颗粒细胞和卵母细胞中,Bcl-2/Bax比值差别很大,提示人们在进行体外培养试验时需考虑环境因素对基因表达的影响。而为了使细胞凋亡与发情的关系更加明晰,颗粒细胞和黄体中相应蛋白的表达情况需要进一步深入研究。

雌性动物进入卵泡期后,E2水平会出现波峰[25]进而引起排卵前LH峰;此时P4的含量也会增加,刺激卵泡壁中胶原纤维酶的活性以溶解卵泡壁。而在黄体期,由于分泌P4的黄体体积达到最大,所以产生的孕酮也达到最大值[25]。本研究中,卵泡期和黄体期E2的含量没有显著性差异,原因可能是采样时间并不是标准的E2的峰值时间;黄体期P4含量显著高于卵泡期,符合黄体期的生理特征。

颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的根本原因[26]。E2可以抑制多种细胞的凋亡[27-28],它能抑制Ca2+和Mg2+依赖性的核酸内切酶的活性,该酶一旦激活,细胞的DNA核小体间发生不可逆的裂解。有研究表明,正常组E2水平显著高于凋亡组,E2很可能通过上述途径发挥它对颗粒细胞的保护作用[29]。本研究中,血清中E2含量在黄体期和卵泡期没有显著性差异,但是黄体期血清E2含量有高于卵泡期的趋势,而促凋亡基因Bax和抑制凋亡基因Bcl-2在黄体期卵巢中的表达量都高显著于卵泡期(P < 0.05),所以本研究的结果也可以得到推论:在雌激素含量相对较低的卵泡期,细胞凋亡增加,而这种看似无用的细胞凋亡,促使了优势卵泡的发育,启动发情。另一方面,孕激素可能通过作用于孕激素受体对体外分离培养的颗粒细胞凋亡发挥抑制作用[30]。本研究是体内试验,黄体期血清P4含量显著高于卵泡期(P < 0.05),而黄体期是凋亡受到抑制的时期,与以上研究结果一致。

随着优势卵泡的进一步发育, 卵泡抑制素和雌激素分泌增加, 进而降低FSH的分泌水平, 并且优势卵泡还会分泌抑制素, 以旁分泌方式作用于周围卵泡, 使得未被优势化的卵泡成熟发育受阻, 以此参与卵泡选择[31]。试验证明, 雌激素在决定优势卵泡的形成过程中起决定性作用,雌激素与FSH协同,一方面增加颗粒细胞中LH受体分化,同时它又促进颗粒细胞芳香化酶的合成,后者进一步促进颗粒细胞雌激素的合成,形成良性循环。故如果同时启动的一组原始卵泡,其中有一个卵泡分泌比其他卵泡较多的雌激素,这个卵泡将进入良性循环状态, 也只有这个卵泡的颗粒细胞能分泌出足够的LH受体, 应答垂体LH分泌峰的作用而排卵;而与其一同生长的其他卵泡由于分泌较少的雌激素, 在卵泡发育不同阶段走向闭锁,卵泡闭锁有两种类型:一种起始于颗粒细胞一种起始于卵母细胞[32],而起源于颗粒细胞的卵泡闭锁中,Bcl-2家族成员的相互作用而引起的颗粒细胞凋亡起到了很大作用,进而促进了发情启动。

4 结论

BadBaxBcl-2、Bcl-xL 4个凋亡相关基因在不同组织、不同时期表达存在差异,BadBcl-2在黄体期垂体和卵巢组织的表达量均显著高于卵泡期,黄体期孕酮含量显著高于卵泡期,表明凋亡相关基因在调控小尾寒羊常年发情性状中起到一定作用,其中BadBcl-2基因可能调控黄体期到卵泡期发情状态的转换,与小尾寒羊发情启动有关。

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