2. 山西农业大学生命科学学院, 太谷 030801;
3. 山西医科大学基础医学院, 太原 030001
, ZHAO Yu-jun1, DU Bin1, ZHANG Ya-ling1, ZHU Zhi-wei2, XIE Jian-shan3, FAN Rui-wen1, YU Xiu-ju1, DONG Chang-sheng1
2. College of Life Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China;
3. School of Basic Medical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China
动物的肤色是由表皮角质细胞中黑色素的种类和数量决定的，黑色素的生成是一个复杂的过程，在黑色素细胞中，黑素体是产生黑色素特有的细胞器，在黑色素生成过程中会产生具有细胞毒性的多巴醌，因此黑色素必须在黑素体中生成，黑色素有真黑素和褐黑素2种类型，随黑素体到达表皮角化细胞的黑色素种类、数量和比例决定了动物的肤色和毛色。黑色素的生成受多个基因的调控，但酪氨酸酶(TYR)及其相关蛋白是黑色素生成的重要调控因子，TYR是黑色素生成的限速酶，酪氨酸相关蛋白酶1(TYRP1)和酪氨酸相关蛋白酶2(TYRP2)主要参与调控真黑素的生成，小眼畸形相关转录因子(MITF)也是黑色素形成的关键因子, 该因子通过结合TYR、TYRP1和TYRP2共有的启动子保守元件——即含有CATGTG保守序列的M-box盒子而调控TYR、TYRP1和TYRP2的表达，进而调控黑色素的生成[1]。
MicroRNAs (miRNAs)是一类小的非编码RNA，一般由20个左右的核苷酸组成，它们通过部分碱基(一般7~8个碱基)之间碱基互补的方式结合到靶基因的3′非翻译区，miRNAs一旦与靶基因结合就会导致mRNA的降解或抑制靶基因蛋白的翻译，因此miRNAs对靶基因的调控是转录后调控，并且大多数是负调控[2-3]，最近也发现，有些miRNA是正调控，如miR-66对sGC基因的调控就是正调控[4]，但其调控机制目前还不清楚。
近年来已经发现有多种miRNA参与调控皮肤黑色素的形成，如miR-434通过抑制TYR的表达从而使皮肤变白[5]；miR-25、miR-218、miR-137通过调控MITF的表达使黑色素的生成减少[6-8]，miR-145、miR-193、miR-324通过调控靶基因减少皮肤黑色素的沉积等[9-11]。有文献报道，miR-186与许多种癌症的形成有关，并称它为一种“癌症抑制因子”，H.J.Qiu等[12-13]研究发现，miR-186在黑色素瘤组织和黑色素瘤细胞中表达异常，且miR-186过表达影响黑色素瘤细胞的增殖、迁移，因此推断，miR-186可能与正常黑色素细胞的功能有关，与正常黑色素细胞的迁移、增殖有关，也可能与毛色的形成有关。
综上，miRNAs通过调控与黑色素生成相关的各种因子来调节黑色素的生成，而且研究表明，很多因素如一些炎症介质和细胞因子SCF、ET-1、神经生长因子等不仅能促进体外黑色素细胞的增殖，并且对黑色素细胞的运动及TYR的活性都有显著的影响[14-15]，但关于miRNAs对细胞增殖、迁移的影响大都集中在癌症、肿瘤细胞的研究中[16-17]，本研究通过TargetScan、miRBase等数据库预测miR-186的靶基因，并通过在体外培养的正常绵羊黑色素细胞中转染miR-186表达载体来探究其对正常黑色素细胞增殖和迁移的影响。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 miRNAs载体的构建及引物合成miRNAs的真核表达载体为pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR (Invitrogen)，该表达载体上连有绿色荧光报告蛋白(Green fluorescent protein，GFP)，可根据有无绿色荧光判断转染效果，miR-186-5p真核表达载体、阴性对照真核表达载体、抑制miR-186的真核表达载体均由Invitrogen公司构建，绵羊黑色素细胞系由本实验室分离鉴定培养，相关引物(表 1)由北京六合华大科技股份有限公司合成。
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表 1 引物序列 Table 1 The primer sequences |
Trizol试剂(Invitrogen，美国)，壮观霉素、反转录PCR试剂盒(TaKaRa, 大连)，黑素细胞培养基(ScienCell，美国)，质粒中提试剂盒(QIAGEN，美国)，SYBR Prime Script TMRT PCR KIT (TaKaRa，大连)，高速低温冷冻离心机(Sigma，德国)，超净工作台(SW-CJ-CO，苏州)，7500 Fast Real time PCR System(Life technologies，美国)，核酸蛋白测定仪(Thermo，美国)。
1.2 试验方法 1.2.1 皮肤样品的采集本试验随机选择3只头颈部有黑色斑点的成年苏尼特羊为试验对象，按照山西农业大学试验动物管理办法，进行麻醉取材。黑色和白色被毛部位分别取1 cm2皮肤组织各3块，皮肤离体后迅速置于液氮中备用。
1.2.2 黑色素细胞的复苏绵羊黑色素细胞系由本实验室保存。从液氮中取出细胞，迅速放入37 ℃预热的水浴中溶解复苏，离心收集细胞后，新鲜培养基重悬细胞，最后将细胞均匀的接种于6孔细胞培养板中，37 ℃，5% CO2条件下在细胞培养箱中培养。24 h后更换新鲜培养基，细胞密度长到80%左右时进行传代或转染。
1.2.3 黑色素细胞的转染传代后，黑色素细胞密度达到80%左右时进行转染。为了提高转染效率，制备不含双抗的转染用培养基，经预试验验证6孔板每孔3 μg质粒转染效果最佳。在1个1.5 mL的离心管中加入250 μL的转染用培养基和3 μg的含有miRNAs的质粒DNA，二者混匀孵育5 min备用，在另1个1.5 mL的离心管中加入250 μL的转染用培养基和6 μL的DNA转染试剂混匀，然后将2个离心管中的溶液混合并孵育20 min。期间除去细胞中的培养基，每孔中添加1 mL的转染用培养基，最后将含有DNA转染试剂与DNA复合物的混合物均匀接种于培养孔中，置于CO2细胞培养箱中培养，24 h后用完全培养基终止转染，继续培养48 h后收集细胞备用。做划痕试验的细胞转染后，用10 μL枪头在培养孔中轻轻划出痕迹，最后将培养板置于细胞培养箱中培养，每隔24 h观察划痕处细胞生长情况，并拍照记录。
本试验设计了试验组(miR组，转染miR-186-5p真核表达载体)、阴性对照组(NC组，转染NC真核表达载体)、抑制组(inhibitor组，转染抑制miR-186-5p的真核表达载体)，每组设9个重复，其中3孔细胞用于黑色素含量测定, 3孔细胞用于提取总RNA，另外3孔细胞用于划痕试验。
1.2.4 细胞黑色素含量测定转染48 h后去除培养基，PBS冲洗细胞3次并进行细胞计数，80 ℃金属浴中0.2 mol·L-1NaOH裂解细胞，裂解液加入酶标板，每个样品3个重复，使用酶标仪记录波长475 nm时的吸光值，根据细胞计数值与475 nm时的吸光值计算各组黑色素的相对含量(μg·10-6个细胞)
1.2.5 Real-time RT-PCR检测取出液氮中保存的皮肤组织，在液氮中研磨，根据Trizol法提取皮肤总RNA，然后用反转录试剂对总RNA进行反转录，获得不同绵羊毛色皮肤cDNA。体外培养的绵羊黑色素细胞转染48 h后，方法同上制备cDNA。
根据已有关于miR-186-5p在皮肤各种疾病中作用的报道，推测其与毛色可能存在一定的关系，在miRBase数据库中查找相关序列，并根据已知序列设计绵羊miR-186和U6的RT-PCR扩增引物，引物序列见表 1。按照荧光定量试剂使用说明进行RT-PCR试验，cDNA样品浓度统一后作为RT-PCR的模板，每个样品重复3次。反应体系10 μL：SYBR Premix 5 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA模板1 μL、RNase Free H2O 3.6 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸10 s；40个循环。
1.3 数据分析miR-186-5p的mRNA表达水平、各试验组黑色素含量等指标都采用SPSS软件进行差异显著性分析，结果以“均值±标准差(Means±SD)”表示，其中miR-186-5p的相对表达量采用2-ΔΔCT方法计算，以U6为内参基因。
2 结果 2.1 不同绵羊毛色皮肤中miR-186-5p mRNA表达水平的差异RT-PCR结果表明，绵羊白色和黑色被毛皮肤中均有miR-186-5p表达，但白色皮肤中miR-186-5p mRNA表达高于黑色皮肤且差异显著(P＜0.05)(图 1)，是黑色皮肤的2.56倍，说明miR-186-5p与皮肤毛色有关。
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*. P<0.05. The same as below 图 1 不同毛色绵羊皮肤中miR-186-5p mRNA表达水平 Figure 1 Expression analysis of miR-186-5p in white and black sheep skins |
miRNAs靶基因预测软件分析结果表明，MITF是miR-186-5p的靶基因之一，并且与miR-186-5p的结合位点在MITF 3′UTR的970~977 bp区域(图 2)，由图 2可知，各种动物MITF 3′UTR序列相对保守，且与miR-186-5p结合的序列大都是AUUCUUUA，而miR-186-5p的结合序列是UAAGAAAC。
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图 2 miR-186-5p与MITF 3′UTR的结合位点 Figure 2 The binding site of miR-186-5p to MITF 3′UTR |
转染48 h后，在倒置显微镜下观察转染绵羊黑色素细胞中绿色荧光表达情况，由图 3可见所有转染了真核表达载体的细胞都有均一的绿色荧光，而没有转染的正常绵羊黑色素细胞没有绿色荧光，说明转染良好，各表达载体都成功转入目的细胞。
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A. miR组；B. NC组；C.正常绵羊黑色素细胞；D. inhibitor组 A. miR-186-5p-sheep melanocytes; B. miR-186-NC-sheep melanocytes; C. Normal sheep melanocytes; D. miR-186-inhibitor-sheep melanocytes 图 3 黑色素细胞的转染效率(100×) Figure 3 The efficiency of transfecting in melanocytes (100×) |
转染后，各组转染细胞中miR-186-5p mRNA的表达差异结果如图 4所示，miR组miR-186-5p的表达量明显上升，是NC组的1.56倍，且差异极显著(P＜0.01)，而inhibitor组miR-186-5p的表达量明显降低，与NC组相比下降了3.03倍，且差异极显著(P＜0.001)，说明各组细胞转染成功，且绵羊黑色素细胞中转染miR-186-5p表达载体能促进miR-186-5p的表达，而其抑制载体也能抑制其表达，说明各个载体构建成功。
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**. P<0.01; ***. P<0.001 图 4 各转染组中miR-186-5p mRNA表达水平检测 Figure 4 Expression analysis of miR-186-5p in different transfected groups |
黑色素含量测定结果显示，miR组的黑色素含量明显降低，与NC组相比下降了2.33倍，且差异显著(P＜0.05)，而inhibitor组的黑色素含量则明显升高，与NC组相比提高了1.34倍，差异显著(P＜0.05)(图 5)。由此可见，黑色素细胞中转染miR-186-5p能下调黑色素的生成，而抑制miR-186-5p表达的细胞中黑色素的生成增加，由此说明miR-186-5p能抑制黑色素的生成。
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图 5 各转染组的黑色素含量 Figure 5 Melanin content in different transfected groups |
黑色素细胞转染后轻轻划出痕迹，如图 6每张细胞片中没有细胞的区域是划出的痕迹，0、24、36、48 h观察划痕处细胞的生长情况并拍照，由图 6可看出，转染24 h后各组细胞划痕处细胞生长情况差不多，划痕处细胞增殖不明显，只有inhibitor组在划痕处看到有少数细胞的生长，各组细胞划痕处细胞生长及其差异主要出现在转染36 h后，由图 6可看出，转染36 h后miR组划痕处细胞最少，inhibitor组划痕处细胞最多，NC组划痕处细胞密度介于二者之间。转染48 h后划痕处细胞基本长满，但inhibitor组划痕处细胞密度最大，基本看不到划痕，而miR组和NC组划痕处细胞密度相对较小，划痕痕迹依稀可见，但NC组划痕处细胞密度又较miR组大。总之inhibitor组划痕处细胞长得最快，其次是NC组，最后才是miR组，由此可见，miR-186-5p抑制了绵羊黑色素细胞的增殖和迁移，而抑制miR-186-5p表达则会促进黑色素细胞的增殖和迁移。
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A. miR组；B. NC组；C. inhibitor组。1~4.分别为转染后0、24、36、48 h A. miR-186-5p-sheep melanocytes; B. miR-186-NC-sheep melanocyts; C. miR-186-inhibitor-sheep melanocyts. 1-4. Post transfection 0, 24, 36, 48 h 图 6 划痕试验检测各转染组黑色素细胞的增殖和迁移能力(40×) Figure 6 Capacity of migration and proliferation in different transfected groups by wound-healing assay (40×) |
miRNAs是一类含有18~25个核苷酸的内源性非编码RNA，通过部分碱基互补的方式结合到靶基因mRNA的3′-UTR并对该基因进行转录后调控[3]，大量研究表明，miRNAs参与细胞的生长、分化和凋亡，并在动物的生长发育和疾病的发展过程中起调控作用，而且大多数miRNAs对靶基因是负调控。
近年来对miRNAs的研究主要集中在各种肿瘤(如肺癌、乳腺癌、颅脑肿瘤、肝癌、胃癌、胶质瘤及淋巴瘤等)的形成方面[18-21]，miRNAs对正常细胞的调控研究比较少，已有的关于miR-186-5p的报道也大都集中在肿瘤、癌症等的研究中，而且其对靶基因的调控也大都是负调控，如C.H.Cao等[16]报道miR-186通过抑制靶基因Twist1的表达抑制胃癌细胞的侵染、增殖和迁移，X.Hua等[17]报道miR-186通过抑制GOLPH3基因抑制前列腺癌细胞的增殖，K. Yao等[22]报道miR-186通过抑制NSBP1的表达抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭，本研究发现，绵羊毛色越深的皮肤中miR-186-5p表达越低，而通常肤色和毛色的颜色越深黑色素含量越高，由此可见，在绵羊体内miR-186-5p对黑色素生成的调控与对癌细胞的调控都是负调控，本研究还发现，在体外培养的正常绵羊黑色素细胞中过表达miR-186-5p，其黑色素含量明显降低，说明在体外培养的正常黑色素细胞中miR-186-5p对黑色素的生成也同样是负调控。
miRNAs在细胞增殖、分化、凋亡及维持胚胎干细胞的潜能等多种生理过程中都发挥重要作用[23-24]，并已证实在肿瘤形成过程中miRNAs可作为癌基因或抑癌基因来调节细胞的增殖和凋亡[25-27]。F. Chen等[28]研究发现，miR-186抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，J. C. Cai等[29]发现，miR-186通过抑制细胞周期抑制肺癌细胞的增殖迁移，W. He等[30]发现，miR-186抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖、侵袭和细胞凋亡，Z.Y.Liu等[31]发现，在多发性骨髓瘤(MM)细胞系和骨髓瘤患者的组织细胞中miR-186表达下调，而且在体外培养的骨髓瘤细胞中过表达miR-186会显著抑制体细胞的生长，并使细胞周期停滞在G0/G1期。本研究划痕试验发现，miR-186-5p抑制了绵羊黑色素细胞的增殖和迁移，同对肿瘤细胞的增殖、迁移影响一致，miR-186-5p对绵羊黑色素细胞增殖、迁移的抑制可能是通过抑制细胞周期实现的。
另外，笔者通过miRBase、TargetScan等生物信息学网站分析，预测MITF是miR-186-5p可能的靶基因之一，miR-186-5p可能通过直接与MITF的3′UTR区结合而调控MITF的翻译。而MITF主要在色素细胞中表达，是黑色素形成的关键因子，MITF突变会导致一系列的表型变化，如眼的色素缺失、减退等，此外MITF还与细胞周期、分化、衰老、凋亡、增殖和迁移等有关，在黑色素瘤细胞中过表达MITF能促进黑色素瘤细胞增殖[32-33]，黎钊等[34]研究发现，正常人黑色素细胞能显著表达MITF，而白癜风患者皮肤的MITF表达显著减少，我们推断，miR-186-5p对绵羊黑色素细胞中黑色素生成及对黑色素细胞增殖、迁移的抑制作用也可能是通过下调MITF的表达实现的，miR-186-5p对黑色素细胞的作用机制尚需进一步的研究。
4 结论在绵羊不同毛色皮肤中miR-186-5p的表达存在差异，而且在浅色皮肤中高表达，在正常绵羊黑色素细胞中过表达miR-186-5p能抑制黑色素的产生，抑制黑色素细胞的增殖和迁移。
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