阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD),又称老年痴呆症,是一种中枢神经系统退行性疾病。AD最主要的病理学改变是大脑皮质中出现大量的老年斑和神经元中出现大量的神经纤维缠结^[1],前者的核心结构是β-淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ),它可以导致氧自由基的产生及线粒体的损伤,从而引起神经细胞的凋亡^[2]。实验证明,17β-雌二醇(E₂)可以通过调节白细胞介素-6(IL-6)来减少Aβ的产生,还能帮助神经细胞抵抗Aβ产生的神经毒性^[3]。另外,E₂还能提高Aβ分解酶neprilysin的表达来降解Aβ^[4]。但Aβ对神经胶质细胞的影响目前研究较少。而神经胶质瘤细胞的形态以及功能与神经胶质细胞相似,经常用于研究神经胶质细胞氧化应激等功能^[5]。因此,本实验以Aβ_25-35损伤的神经胶质瘤母瘤细胞C6为模型,探讨了雌激素对Aβ_25-35诱导损伤C6的保护作用及可能的作用机制,为研究AD的防治提供理论基础。

DMEM培养基购于Invitrogen公司，无酚红DMEM培养基购于吉诺生物医药技术有限公司，胎牛血清(FBS)来自Hyclone公司，活性炭处理胎牛血清购于以色列Biological公司，FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ购于BD Biosciences公司，BDM-mlv逆转录酶购自Promega公司，随机引物(9 mer)购于TaKaRa公司，dNTP混合液来自Roche公司，噻唑蓝(MTT)购于Amresco公司，GPR30(N-15) -R(Sc-48525-R)、ERβ(H-150) (sc-8974) 和ERα(HC-20) (sc-543) 抗体均购于Santa Cruz公司。

C6细胞可生长于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，待细胞长至约80%-90%密度时进行传代。实验前至少3 d，将培养基置换为含有10%活性炭处理胎牛血清的无酚红DMEM培养基。

收集处于对数生长期且生长状况良好的C6细胞，使用全培养液配成细胞悬液，调整细胞浓度以10⁴个细胞/孔接种于96孔培养板上，37 ℃，5%CO₂环境下培养，待细胞贴壁生长状态良好时进行相应的药物处理后，每孔加入3-(4，5-二甲基噻唑-2) -2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液(5 mg/ml)20 μl，37 ℃继续孵育4 h后去除培养液，每孔加入100 μl 二甲基亚砜(DMSO)溶液振荡10 min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪，在570 nm的吸光值下检测各组的吸光度。空白对照组MTT代谢率设为100%，余下各组与对照组相比得出各自的MTT代谢率。细胞存活率计算公式如下：细胞存活率=(实验组光吸收值/对照组光吸收值)×100%。实验重复3次。

根据BD凋亡检测试剂盒说明书进行检测。采用AnnexinV-FITC／PI染色，利用流式细胞仪进行双参数分析，测定坏死、凋亡和正常细胞的百分率。

总RNA的提取方法参照江苏康为世纪试剂试剂盒说明书操作，室温环境下完成。然后取1 μl Random primer(6 mer)，4 μl M-mlv 5×buffer，1 μl dNTP (1 mmol/L)，2 μg RNA，0.5 μl M-mlv逆转录酶，最后加RNAase-free水补至20 μl，37 ℃水浴1 h，完成RNA逆转录过程，98 ℃ 5 min终止反应，得到的cDNA保存于-80 ℃。

取逆转录所得cDNA第一链进行PCR扩增反应，采用20 μl反应体系：10 μl 2×GoTaq Green Master mix(Promega)，8 μl Nuclease free 水，1 μl cDNA，1 μl上下游引物(10 μmol/L)：ERα(目的片段大小480 bp)上游引物5′-GTGCCCTACTACCTGGAGAACG-3′，下游引物5’-GGTTGGCAGCTCTCATGTCTCC3’；ERβ(目的片段大小680 bp)上游引物5′-CCTTACCTGTAAACAGAGAGAC-3′，下游引物 5′-CCAGGAGCATGTCAAAGATTTC-3′；GPR30(目的片段大小217 bp)上游引物5′- TGGTGGTGAACATCAGCTTC-3′；下游引物5′-AAGCTCATCCAGGTGAGGAA-3′；GAPDH(目的片段大小121 bp)上游引物5′-TGCCAAATATGATGACATCAAGAA-3′，下游引物5′-GGAGTGGGTGTCGCTGTTG-3′。95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36个循环，72 ℃ 5 min。

对各样品全细胞蛋白提取液100 ℃水浴中煮沸10 min，利用BIO-RAD电泳和转膜系统，100 V恒压下电泳约1.5 h，400 mA恒流下转膜2 h，5％脱脂奶粉-TBST溶液封闭抗体1 h后，加入一抗4 ℃过夜，TBST将膜漂洗3遍后加入相应的二抗于室温下作用1 h，TBST漂洗3遍，ECL孵育2 min后，用胶片显影。

所有实验结果均由Origin 8.0软件分析处理，使用T检验及One-way ANOVA方差检验来判断实验结果是否有差异。P＜0.05时，差异具有统计学意义。

以5 μmol/L Aβ_25-35处理24 h的C6细胞作为毒性模型，检测不同浓度下的雌激素预处理不同时间对细胞的存活率的影响，实验结果表明：5 μmol/L Aβ_25-35处理下细胞存活率只有(61.3±2.2) % (P＜0.001) ，但是在Aβ_25-35毒性处理之前，用不同浓度雌激素预处理细胞24 h，细胞的存活率均有不同程度的上升，其中雌激素浓度为10 nmol/L时，细胞存活率可以恢复到(78.3±2.1) %(P＜0.01) ，说明雌激素能够抵抗Aβ_25-35产生的细胞毒性，且具有浓度依赖性(图 1A)。此外，10 nmol/L雌激素预处理C6细胞从5 min到24 h，对细胞的活力也均有不同程度的提高，而且从45 min开始就具有较为明显的预保护效果(P＜0.01) (图 1B)。此外，我们通过流式细胞术进一步检测10 nmol/L雌激素预处理45 min对Aβ_25-35损伤C6细胞的影响，实验结果表明：在Aβ_25-35处理组中，凋亡细胞率为32.74%，而在雌激素预处理组中，细胞凋亡率下降到10.34%(图 1C)，说明雌激素在短时间内具有对抗由Aβ_25-35所诱导的C6细胞凋亡的能力，与MTT检测的结果相一致。

图 1(Figure 1)

图 1 在C6细胞中，雌激素具有抗Aβ25-35毒性作用 A.不同浓度的雌激素对C6细胞预处理24 h后，加入Aβ25-35(5 μmol/L)作用24 h，MTT检测细胞存活率。B.雌激素(10 nmol/L) 对C6细胞作用不同时间后，加Aβ25-35(5 μmol/L)作用24 h，MTT检测细胞存活率；所示数据为xx±s，n=3；***P＜0.001，与空白对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001 ，与Aβ25-35实验组比较。C.雌激素(10 nmol/L)预处理C6细胞45 min后，加入Aβ25-35(5 μmol/L)作用24 h，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。R2区为坏死细胞，R3区为晚期凋亡细胞，R4区为正常细胞，R5区为早期凋亡细胞。

在C6细胞中，从RNA水平和蛋白质水平均检测到有GPR30，ERα和ERβ的表达(图 2A、2B)。而雌激素的核受体ER抑制剂ICI182,780和雌激素膜受体GPR30抑制剂G15分别预处理C6细胞，均能一定程度的降低雌激素抗Aβ_25-35毒性作用(图 2C、2D)。显然，E₂抗Aβ_25-35毒性作用与雌激素受体相关。

采用PI3K特异性抑制剂LY294002和PKA特异性抑制剂H89分别与雌激素共作用于C6细胞，检测其对雌激素抗Aβ_25-35损伤的影响，实验结果表明：这两种抑制剂均能阻断雌激素抗Aβ_25-35损伤作用(图 3) ，说明PI3K和PKA信号通路均参与了雌激素抗Aβ_25-35毒性作用的调控。

图 2(Figure 2)

图 2 雌激素受体抑制剂对雌激素抗Aβ25-35损伤的影响 A.雌激素受体的表达：通过RT-PCR检测C6细胞中GPR30、ERα、ERβ的RNA含量；B.雌激素受体的表达：Western-blot检测C6细胞中GPR30，ERα，ERβ的蛋白质表达水平。C.雌激素受体ERα和ERβ的抑制剂ICI182,780对雌激素抗Aβ25-35毒性的影响。ICI182,780(1 μmol/L)预处理C6细胞24 h后，E2(10 nmol/L)作用细胞45 min，最后加入Aβ25-35(5 μmol/L)处理24 h，MTT检测细胞存活率。D. 雌激素受体GPR30抑制剂G15对雌激素抗Aβ25-35毒性的影响。G15(10 μmol/L)预处理C6细胞24 h后，E2(10 nmol/L)处理细胞45 min，最后加入Aβ25-35(5 μmol/L)作用24 h，MTT检测细胞存活率。所示数据为xx±s，n=3；***P＜0.001，与空白对照组比较； ##P＜0.01，与Aβ25-35实验组比较。$P＜0.05，与E2+Aβ25-35实验组比较

图 3(Figure 3)

图 3 PI3K、PKA信号通路抑制剂对雌激素抗Aβ25-35损伤的影响 抑制剂LY294002(20 μmol/L)和H89(20 μmol/L)分别与E2(10 nmol/L)共作用45 min后，再加入Aβ25-35(5 μmol/L)作用24 h，MTT检测细胞存活率。所示数据为xx±s，n=3；***P＜0.001，与空白对照组比较； ##P＜0.01，与Aβ25-35实验组比较。$$P＜0.01，与E2+ Aβ25-35实验组比较

星形胶质细胞是神经系统中数量最多的一种细胞。有研究证明,活化的星形胶质细胞定位于纤维化老年斑周围,它们的生化标记物表达量在阿尔茨海默症病人的大脑中也有高表达,因此星形胶质细胞的病变对于神经元乃至整个中枢神经系统都会有重要影响。

大鼠C6胶质瘤细胞作为一个星形胶质细胞样的细胞系,被广泛应用于星形胶质细胞功能及信号机制等方面的研究; 同时由于C6对外界刺激如Aβ、过氧化氢等反应非常灵敏,各类雌激素受体也均有表达,因此,C6又经常作为AD体外实验的模型^[5]。

在本实验中,MTT检测结果与流式细胞术检测结果均表明:在C6细胞中,E₂可以抵抗Aβ25-35毒性损伤(图 1)。而且由于处理方法是E₂预处理后去除培养基,再加Aβ_25-35,所以我们认为E₂的保护作用可能不是直接与Aβ_25-35发生作用实现的,而是激活了细胞体内的相关生物反应,以抵抗Aβ_25-35毒性。同时,由于预保护处理时间为45 min,作用时间较短,所以E₂抵抗Aβ_25-35毒性的机制可能涉及到直接作用于与凋亡相关的快速信号通路。在这些通路的主要作用下,细胞内抗凋亡的分子上调,C6得以抵抗Aβ_25-35的毒性。而实验也进一步证实:信号通路PKA和PI3K参与了E₂的这种保护作用(图 3)。

此外,近年研究发现:星形胶质细胞主要依赖于星形胶质细胞膜雌激素受体和核雌激素受体在神经退行性疾病中发挥神经保护作用^[6]。由于雌激素受体的作用机制主要有基因组和非基因组两种途径。其中非基因组作用途径通常是通过定位于细胞膜上的雌激素受体,快速激活相关的信号通路,完成下游调控^[7]。但有关雌激素受体在胶质细胞尤其是胶质瘤细胞的表达的报道较少且研究结论不尽一致^[8]。因此,我们从蛋白与基因水平分别检测了雌激素受体在神经胶质瘤细胞(C6)中的表达,而且实验结果表明:其相关的受体抑制剂均可以抑制雌激素的神经保护作用(图 2)。由于近年来研究结果显示,雌激素受体具有核膜双重分布特征^[9],因此我们推测可能是细胞膜上分布的经典核受体ER的膜性成分以及属于G蛋白偶联受体家族的GPR30共同介导了雌激素发挥快速生理调节作用,从而抵抗Aβ_25-35的毒性作用。

综上所述,E₂对Aβ_25-35寡聚体诱导的C6细胞的损伤具有保护作用,且其保护作用机制与C6细胞膜上分布的雌激素受体及PKA、PI3K信号转导途径有关。