2. 江苏省环境保护水环境生物监测重点实验室/常州市环境监测中心, 江苏 常州 213001;
3. 常州市疾病预防控制中心, 江苏 常州 213022
2. Key Laboratory of Environmental Protection of Water Environment Biological Monitoring of Jiangsu Province/Changzhou Environmental Monitoring Center, Changzhou 213001, China;
3. Changzhou Centers for Disease Control and Prevention, Changzhou 213022, China
地下水是水资源的主要组成部分之一, 占全球灌溉水量的40%[1]。近年来, 随着人口的不断增加和社会经济的快速发展, 人类活动对环境造成的污染不断加重, 地下水环境面临不同程度的破坏[2]。目前关于地下水的研究集中于水污染修复、水污染物鉴定以及地表水和地下水的相互作用等方面[3-6], 而我国关于地下水细菌群落的研究还较少。细菌群落特性与水生生态环境具有高度相关性, 群落变化比水文地球化学指标的变化更为敏感, 其结构特征和功能状态可以反映水体生态系统对污染输入胁迫的恢复力[7], 群落多样性被认为是反应环境敏感性的生物指标之一[8], 直接参与碳、氮、硫、磷和一些重金属的生物地球化学循环[9]。
近年来, 分子生物学技术得到快速发展, 研究细菌群落多样性的方法逐步更新, 16S rDNA克隆文库[10]、PCR-DGGE[11]和宏基因组学[12]等技术被用于研究地下水细菌群落特征。工业产业向园区集中已经成为我国工业企业发展的一个趋势, 工业园区地下水污染日趋严重, 对区域生态和人居环境健康构成不利影响[13], 而目前关于利用分子生物学技术对工业园区细菌群落结构和多样性研究还鲜见报道。高通量测序技术是识别细菌群落整体概况的高效工具, 已被广泛应用于多种复杂环境细菌群落结构的研究, 成为分析群落多样性的一种有效手段[14-16]。该研究基于Illumina HiSeq测序平台, 以工业园区地下水为研究对象, 采用高通量测序方法, 研究其细菌群落结构和多样性, 以期为地下水细菌群落研究提供基础数据, 为工业园区地下水生态环境评价提供方法支撑。
1 材料与方法 1.1 研究区概况和样品采集采样区位于常州市某工业园区, 园区内污染源主要集中在北部的盐化工区, 周边建有化工、化肥和制药等环境敏感源。园区内有保存完好的地下水监测井, 减少了钻探工作量。与该研究有关的含水层主要为松散岩类孔隙微承压水层, 含水层岩性为粉土、粉砂和粉质黏土。采样时间为2016年12月, 共选取5口浅层地下水监测井(G1~G5), 监测井水深为9.94~11.99 m, 水位为1.56~3.20 m。工业园区主要地下水污染源、盐化工区、企业用地和5口地下水监测井的相对位置见图 1。
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图 1 工业园区采样点位置示意 Fig. 1 Sampling sites in the industry park |
地下水采样前需进行洗井工作, 待抽出井管中的滞水后, 让含水层中的新鲜水充入井管, 具体的抽水时间根据每口井的水深度和地下水的回水速度而定。完成洗井后, 待地下水水位达到平衡, 使用贝勒管(Safelab-123, 北京赛福莱博科技有限公司)采集地面下2~4 m处的水样。样品采集后, 置于聚乙烯瓶中冷藏保存并运回实验室。用于水体理化指标测定的水样使用0.45 μm孔径的混合纤维素滤膜过滤; 用于高通量测序的水样先经5 μm孔径滤膜过滤除去颗粒杂质, 再通过0.22 μm孔径滤膜过滤, 将其保存于-20 ℃条件下, 用于后续DNA提取。
1.2 理化指标测定理化指标的选取和分类参照GB/T 14848—2017《地下水质量标准》[17], 检测方法参照GB 5750—85《生活饮用水卫生标准》[18]。所测定指标包括14项一般化学指标(pH值、总硬度、硫酸盐、氯化物、铁、锰、铜、锌、挥发酚、阴离子表面活性剂、高锰酸盐指数、氨氮、电导率和溶解氧), 5项天然背景离子(钠、钙、镁、钾和碳酸氢根), 14项毒理学指标(亚硝酸盐、硝酸盐、氰化物、氟化物、汞、砷、硒、镉、六价铬、铅、三氯甲烷、四氯化碳、苯和甲苯), 37项非常规毒理学指标〔二氯甲烷、1, 2-二氯乙烷、1, 1, 1-三氯乙烷、1, 1, 2-三氯乙烷、1, 2-二氯丙烷、三溴甲烷、氯乙烯、1, 1-二氯乙烯、1, 2-二氯乙烯、三氯乙烯、四氯乙烯、氯苯、邻二氯苯、对二氯苯、三氯苯(总量)、乙苯、二甲苯(总量)、苯乙烯、2, 4-二硝基甲苯、2, 6-二硝基甲苯、萘、蒽、荧蒽、苯并(b)荧蒽、苯并(a)芘、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、2, 4, 6-三氯酚、五氯酚、六六六、2, 4′-滴滴涕、六氯苯、七氯、敌敌畏、甲基对硫磷、马拉硫磷、乐果和毒死蜱〕。
1.3 DNA提取按照试剂盒说明书步骤, 使用Omega Water DNA Kit(Omega, USA)提取地下水样品DNA。为减少实验误差, 做3次平行, 完成DNA提取后用NanoDrop 2000超微量蛋白质核酸分析仪(Thermo Fisher, USA)测定提取出的DNA浓度和纯度后, 混匀为1个样品并置于-20 ℃条件下保存, 用于后续的PCR扩增。
1.4 PCR扩增将提取好的DNA产物使用16S rDNA V3~V4区引物(338F/806R)进行PCR扩增。PCR扩增体系总计20 μL, 含4 μL的5X FastPfu缓冲液, 2 μL的dNTPs(2.5 mmol·L-1), 0.8 μL的正向引物(5 μmol·L-1), 0.8 μL的反向引物(5 μmol·L-1), 0.4 μL的FastPfu聚合酶, 10 ng的DNA模板, 补超纯水至20 μL。PCR扩增过程:95 ℃预变性2 min, 95 ℃变性30 s, 55 ℃退火温度下反应30 s, 72 ℃延伸90 s, 共25个循环, 最后72 ℃下延伸10 min。PCR产物使用w=2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测; 根据PCR产物浓度进行等量混样, 充分混匀后使用φ=2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 对目的条带使用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen, Germany)回收试剂盒回收产物。
1.5 高通量测序纯化后的产物经Hiseq PE250平台(Illumina, USA)进行高通量测序和分析。使用TruSeq® DNA PCR-Free样品制备试剂盒(Illumina, USA)建库试剂盒进行文库构建, 构建好的文库使用Qubit @ 2.0荧光计(Thermo Scientific, USA)和Agilent Bioanalyzer 2100系统(Agilent, USA)评估测序文库质量。
1.6 统计分析使用Uparse软件(版本为7.0.1001)进行序列分析, 基于有效数据划分操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs), 具有≥97%相似性的序列被分配给相同的OTU, 筛选每个OTU的代表序对比Silva数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8~1)[19]。为研究不同OTU的系统发育关系, 以及不同样本中优势种的差异, 使用Muscle软件(版本为3.8.31)进行多序列比对。通过Qiime软件(版本为1.7.0)计算地下水样品Alpha多样性指数[20]。环境因子与细菌群落的相关性研究首先经除趋势对应分析排序(detrended correspondence analysis, DCA), 通过分析结果中第1轴的梯度长度, 选定冗余分析(redundancy analysis, RDA)提取显著解释细菌群落的环境因子[21]。
2 结果与分析 2.1 水质理化性质分析工业园区5口地下监测井水质的理化分析结果见表 1和表 2, 在地下水样品中共有12项一般化学指标、5项天然背景离子, 3项毒理学指标和2项非常规毒理学指标被检出; 其中, 铜、锌、镉、1, 2-二氯乙烯和三氯乙烯仅在G5点位被检出。
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表 1 地下水样品的理化指标、类别和综合评价 Table 1 Physical and chemical properties, categories and comprehensive evaluation of groundwater samples |
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表 2 地下水样品的电导率、溶解氧及天然背景离子浓度 Table 2 Conductivity, dissolved oxygen and natural background ion concentrations of groundwater samples |
根据地下水各指标含量特征及限值进行分类, 参与地下水质量评价的有16项(表 1), 其中7项指标均为Ⅰ类, 12项指标均在Ⅱ类以内, 锰和镉在G5点位为Ⅴ类。根据GB/T 14848—2017[17]对地下水监测井水质进行综合评价, 结果表明5口地下水监测井综合类别分别为Ⅳ、Ⅲ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ类, 锰为所有采样点最差类别指标。
除参与地下水质量评价的16项理化指标外, 地下水各采样点的电导率、溶解氧及天然背景离子测定结果见表 2。电导率和溶解氧在各采样点变化范围分别为421~662 μS·cm-1和5.21~8.22 mg·L-1, 钙、镁、钾和碳酸氢根均以G5点位浓度最高。
2.2 细菌群落结构与多样性经高通量测序, 地下水样品共计得到403 355条高质量基因序列, 最终5个采样点地下水样品获得注释信息的基因总序列有392 956。在97%分类水平下, 各个采样点的OTUs分别为G1:1 260;G2:1 761;G3:1 834;G4:1 426和G5:1 244, 将不同地下水样品的OTU分布进行Venn图分析, 以解释不同样品细菌群落结构之间的差异[22], 结果见图 2。5个地下水样品中均有分布的OTU数为362, 共有OTU数最多的是G2和G3(1 300), 最少的为G1和G3(120), 表明G2和G3样品细菌群落组成的同源性较高[23]。各样品特有的OTU数从大到小依次为G3(292)、G2(290)、G4(236)、G5(138)和G1(128)。
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图 2 不同样品OTU分布Venn图 Fig. 2 Venn diagrams of OTU analysis of each sample |
稀释曲线(图 3)表明各采样点地下水样品在有效测序数达到45 000时, 曲线渐进平缓, GW2和GW3样品在测序条数相同时, 所产生的OTU更多, 实际各样品用于OTU注释的测序数为53 367~76 779, 满足后续测序要求[24]。稀释曲线反映出各个采样点聚类产生的OTUs为G3>G2>G4>G1>G5, 这与图 2所述一致。同时反映各采样点样品OTU覆盖率的Coverage指数均达到0.99以上(表 3), 可以证明测序效果较为理想。
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图 3 地下水样品的稀释曲线 Fig. 3 Rarefaction curve of groundwater samples |
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表 3 Alpha多样性指数 Table 3 Alpha diversity index |
通过描述群落丰富度、均匀度和多样性的Alpha多样性指数来解释地下水细菌群落物种组成情况[25], 由Shannon指数反映出各采样点细菌群落多样性和均匀度均为G2>G3>G4>G1>G5, 由Chao1指数和ACE指数反映出各采样点细菌群落丰富度均为G3>G2>G4>G1>G5(表 3)。G5点位的细菌多样性和丰富度最低, 这主要是由于G5点位化学组分含量高(表 1~2)。
2.3 细菌群落结构注释物种分类信息表明未能在门、纲、目、科、属和种分类水平上进行分类的基因序列比例分别为0.41%, 1.37%, 4.19%, 6.49%, 32.03%和90.99%。物种注释结果表明地下水样品共检出55个细菌门, 图 4为门分类水平下地下水各采样点的菌群结构。相对丰度最高的是变形菌门(Proteobacteria, 86.40%), 各采样点Proteobacteria占比大小为G5>G1>G4>G3>G2。同时4类变形菌纲是地下水细菌群落中的优势细菌纲, 其中占比重较高的是γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria, 47.51%)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria, 29.58%)和α-变形菌纲(Alphaproteobacteria, 6.75%), δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria, 1.90%)平均相对丰度较低。拟杆菌门(Bacteroidetes, 5.06%)和厚壁菌门(Firmicutes, 3.04%)是平均丰度排名第2和第3的优势类群; 其中Bacteroidetes和Firmicutes以G3点位相对丰度最高。此外, 相对丰度较高的细菌门依次为浮霉菌门(Planctomycetes, 0.64%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae, 0.40%)、酸杆菌门(Acidobacteria, 0.42%)、蓝藻门(Cyanobacteria, 0.57%)和绿弯菌门(Chloroflexi, 0.28%), 将占比较低的细菌类群归为其他类。
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图 4 不同分类水平的地下水细菌组成 Fig. 4 Cluster stacking graph of groundwater bacterial composition at different classification levels |
各采样点属分类水平菌群结构有所差异, 相对丰度大于1%的优势细菌属有13个。相对丰度排名前3的优势细菌属分别为假单胞菌属(Pseudomonas, 16.38%), Perlucidibaca(9.17%)和不动杆菌属(Acinetobacter, 8.12%), 其中G1点位的Pseudomonas和Acinetobacter的占比较高, 分别为25.49%和20.43%。该研究检出的地下水细菌群落中共有564个细菌属, 除Pseudomonas、Perlucidibaca和Acinetobacter外, 其余优势细菌属相对丰度均低于4%。
Proteobacteria为地下水中最具优势的细菌类群, 选取Proteobacteria中排名前15的细菌属进行物种分类(图 5), 这些细菌属均为地下水细菌群落中的优势类群。假单胞菌目(Pseudomonadales, 38.76%)为相对丰度最高的细菌目, Pseudomonas、Perlucidibaca、Acinetobacter和Alkanindiges(2.41%)等细菌属均隶属于假单胞菌目。伯克氏菌目(Burkholderiales, 22.74%)为地下水细菌群落中第2大优势细菌目, 马赛菌属(Massilia, 3.60%)、湖沉积杆菌属(Limnobacter, 1.86%)、噬氢菌属(Hydrogenophaga, 0.63%)和极地单胞菌属(Polaromonas, 0.38%)均隶属于伯克氏菌目。此外, 红环菌目(Rhodocyclales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)和嗜氢菌目(Hydrogenophilales)为地下水细菌群落排名前7的细菌目。
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图 5 优势变形菌门物种分类树 Fig. 5 Species classification tree of predominant Proteobacteria phyla |
细菌群落与环境因子的相关性结合Spearman秩相关和冗余分析进行, 图 6表明环境因子对地下水细菌群落具有一定影响(共选取5个地下水样品中均检出的16项理化指标)。冗余分析结果表明第1主轴对属水平细菌群落方差变化的解释量为61.50%, 第2主轴的解释量为23.30%, 到轴4的累计合理解释量为100%。其中氯化物、电导率、总硬度、钠、镁、硝酸盐碳酸氢根、硫酸盐、钙和溶解氧与第1主轴和第2主轴都呈负相关; 钾、铁、锰和pH值与第1主轴和第2主轴都呈正相关; 高锰酸盐指数和氟化物与第1主轴呈负相关, 与第2主轴呈正相关。
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环境因子箭头连线长短代表该环境因子对物种数据的解释量, 箭头连线越长, 解释量越大, 反之越小; 物种箭头连线长度代表该物种被解释量, 箭头连线越长, 被解释量越大, 反之越小; 箭头连线和排序轴以及箭头连线之间的夹角表示两者之间的相关性, 夹角越小, 相关性越大, 反之越小。 图 6 细菌群落与环境因子的RDA分析 Fig. 6 RDA Analysis of relationships between bacterial community and environmental factors |
经分析, 氯化物、钙、电导率、铁、氟化物和硫酸盐是能显著解释细菌群落的环境因子, 解释量分别为0.306、0.256、0.220、0.215、0.207和0.201。其中, 氯化物与盐单胞菌属(Halomonas, r=0.958, P < 0.01)和链球菌属(Streptococcus, r=0.932, P < 0.05)呈显著正相关, 与Polaromonas(r=-0.972, P < 0.01)和气单孢菌属(Aeromonas, r=-0.929, P < 0.05)呈显著负相关; 钙与Hydrogenophaga(r=-0.937, P < 0.05)呈显著负相关; 硫酸盐与Perlucidibaca(r=0.961, P < 0.01)呈显著正相关, 与Massilia(r=-0.921, P < 0.05)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas, r=-0.939, P < 0.05)呈显著负相关。同时, 氟化物、高锰酸盐指数、钾、铁、锰和pH值对G1、G5和G4样本的细菌群落影响较大, 其余理化指标对G2和G3样本的细菌群落影响较大。
3 讨论地下水是地球上最主要且分布最为广泛的水资源之一, 而在人口较为密集、工业生产较为发达地区会由于受人类活动干扰大而使地下水污染越来越严重[26]。不同的细菌群落结构可以产生不同的功能效应, 构成整个生态系统的物质循环和能量转换过程的基础[27]。经高通量测序, 该工业园区地下水细菌群落中相对丰度大于1%的优势类群有Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes, 而这3类细菌类群在鱼塘、河流及湖泊等多种淡水环境中占比丰富[28-30], 表明该工业园区细菌群落具有典型的淡水种群特征。KADNIKOV等[31]对西西伯利亚深层地下含水层未培养细菌进行研究, 结果表明:Firmicutes、Chloroflexi、Proteobacteri和Bacteroidetes为主要优势细菌类群, 但优势细菌所占比重与该研究结果差异较大, 主要是由于这两处地下水理化性质差异所致[32]。
γ-变形菌纲是工业园区地下水中丰度最高的细菌纲, 这与BEYER等[32]关于地下含水层细菌群落的研究结果一致。γ-变形菌纲是目前所知的细菌中种类最多的一纲[33], 而该研究中Pseudomonas、Acinetobacter和Perlucidibaca等优势细菌属均隶属于γ-变形菌纲。LI等[9]发现Acinetobacter, Pseudomonas、冷杆菌属(Psychrobacter)和Alishewanella是高砷地下水中丰度最高的细菌属, 表明Pseudomonas在岩石地层单位中占据主导地位[32]。该研究发现Pseudomonas是工业园区属分类水平上最具优势的细菌类群, 属化能有机营养型微生物, 某些菌株能产生表面活性剂, 有助于有机污染物的降解[34]。Acinetobacter主要分布在水体和土壤中[35], 经常在强还原性的地下水样品中被检出, 被认为具有还原能力[36]; 而在沉积物中占主导地位的氧化细菌Thiobacillus、Hydrogenophaga和土杆菌属(Geobacter)[37-39]在工业园区地下水中也均有检出, 它们能在特定的环境中加速亚铁离子的氧化, 同时参与重金属的氧化还原过程[38]; 推测这些具有特殊功能的细菌在地下水重金属的迁移和转化过程中起到了一定的作用。
地下水含水层是较为极端的微生物栖息地, 环境条件的差异会使细菌群落结构有所不同, 细菌群落结构与所处的理化条件密切相关[40]。有研究表明地下水中的产黄菌属(Flavobacterium)和Aeromonas与溶解性有机碳和钡含量相关, 而Acinetobacter在硅和硝酸盐浓度增加时占优势[32]。而砷、总有机碳、硫酸根离子和亚铁离子是形成地下水微生物群落结构的重要环境因素[9], 但目前尚不清楚影响地下水微生物群落结构的重要环境因素。该研究经冗余分析发现影响工业园区地下水细菌群落结构的主要环境因子为氯化物、钙、电导率、铁、氟化物和硫酸盐, 不同环境因子对不同细菌类群影响不同; 同时不同点位细菌群落受环境因子的影响有所不同(图 6), 研究表明微生物也会参与到地下水中各种化学物质的氧化还原[9], 可见, 微生物与地球化学过程之间的复杂相互作用维持着地下水环境细菌群落的生态平衡和物质转换。该研究以工业园区为背景, 在水质分析的基础上研究不同点位细菌群落结构及多样性差异[41]。水质分析结果表明该工业园区部分点位地下水受到不同程度的污染(表 1), 其中水质情况较好的点位(G2和G3)地下水细菌群落丰富度和均匀度较高(表 3)。G5位于园区北部(周边建有化工、化肥和制药等环境敏感源), 化学组分含量相对较高, 检出特征指标:硝酸盐、氟化物、镉、1, 2-二氯乙烯和三氯乙烯, 水质综合类别为V类(表 1和表 2), 其细菌群落丰富度和均匀度也最低(表 1和表 3), 可见水质情况影响着细菌群落组成和多样性, 这与WANG等[42]对太湖进行不同污染源对细菌群落影响的研究结果一致。
综上所述, 通过Hiseq高通量测序技术对工业园区地下水细菌群落结构和多样性进行了分析, 发现Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes为主要的优势细菌门, 其中Proteobacteria占据总基因丰度的86.40%(以γ-变形菌纲为主), 工业园区地下水细菌群落呈现出典型的淡水种群特征。水质情况影响着工业园区地下水细菌群落组成和多样性, 经冗余分析发现氯化物、钙、电导率、铁、氟化物和硫酸盐是能显著解释细菌群落的环境因子, 不同环境因子对不同细菌类群和不同样本的细菌群落影响有所不同。
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