2. 生态环境部南京环境科学研究所, 江苏 南京 210042
2. Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Ecology and Environment, Nanjing 210042, China
腈是一类含氰基基团(C—R≡N)的有机化合物，种类繁多且在自然界分布广泛，例如苯甲腈天然存在于焙烤过的花生、榛子、可可和奶制品等。苯甲腈类化合物也是重要的有机合成原料和中间体，在医药、农药、染料、香料、缓蚀剂及液晶材料方面有着广泛的应用。苯甲腈类具有毒性，能引起动物组织的痉挛、神经麻痹等[1]；另外，它对环境也有一定的危害，可造成水体和土壤的污染。已报道的消除苯甲腈污染的方法中以化学降解法居多，如LIU等[2]和ZHANG等[3]用化学吸附的方式降低苯甲腈的污染；孔令仁等[4]利用光化学法降解水体中的苯甲腈类污染物。相比于化学降解法，微生物酶解法降解腈类污染物具有高效性、高选择性、反应条件温和、环境污染小等优点[5]，因此利用微生物酶系降解腈类污染物越来越受到青睐。
微生物降解腈类由腈转化酶(nitrile-converting enzyme)催化(图 1)[6]。根据酶的不同，将腈类降解分为2条途径，一是在腈水解酶(nitrilase，EC3.5.5.1)催化下由腈类直接转化为羧酸，这种酶在微生物中普遍存在，例如，周冬杰等[7]利用高通量筛选法从土壤中分离的金黄杆菌属(Chryseobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)可利用该酶降解对羟基苯甲腈。Paraburkholderia graminis腈水解酶具有广泛的底物选择性，可降解脂肪族丙烯腈、杂环的3-氰基吡啶及芳香族苯乙腈和苯甲腈[8]。DENNETT等[9]研究表明Pyrococcus sp. M24D13腈水解酶对苯甲腈和丁腈具有很高的降解活性。另一条腈类降解途径是由腈水合酶(nitrile hydratase，EC4.2.1.84)和酰胺酶(amidase，EC3.5.1.4)联合作用，将腈类先降解为相应酰胺，然后由酰胺酶催化产生羧酸和氨气，如Corynebacterium sp. C5利用这一途径降解苯甲腈[10]；VESELA等[11]报道的Rhodococcus rhodochrous PA-34和R. erythropolis A4腈水合酶-酰胺酶可降解苯甲腈及苯甲腈类除草剂。相对于腈水解酶途径，利用腈水合酶-酰胺酶途径降解苯甲腈的报道较少，特别是对这一途径中苯甲酰胺酶的研究鲜见报道[12]。
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图 1 苯甲腈的降解途径 Fig. 1 The pathways for degradation of benzonitrile |
笔者发现草木樨箭菌(以前称为草木樨中华根瘤菌)Ensifer meliloti CGMCC 7333可降解含氰基的新烟碱类杀虫剂啶虫脒和噻虫啉，并证明其腈水合酶将这2种农药代谢为酰胺类产物[13]。采用全基因组已测序的En. meliloti 1021代谢氰基化合物，发现En. meliloti 1021可降解苯甲腈。En. meliloti 1021是一种根瘤菌，不仅可以与草木樨属(Melilotus)的植物结瘤，还可与苜蓿属(Medicago)和葫芦巴属(Trigonella)内的某些种共生固氮[14]，因此，En. meliloti 1021既可作为有机污染物降解菌株用于消除环境污染，又可固氮用作生物氮肥。为此，笔者开展了En. meliloti 1021降解苯甲腈的代谢途径和代谢酶基因的克隆表达研究，以期为消除环境中苯甲腈污染物提供理论依据和参考价值。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试剂苯甲腈、苯甲酰胺、苯甲酸、3-吲哚乙腈、3-吲哚乙酰胺、3-氰基吡啶、烟酰胺、敌草腈、氟虫腈、溴虫腈、丙烯酰胺、乙酰胺和苯乙酰胺购于美国Sigma-Aldrich公司(试剂纯度w在98%以上)，色谱级乙腈购于美国Tedia公司。
1.1.2 试验菌株和质粒En. meliloti 1021由实验室尚广东老师提供，Escherichia coli Rosetta (DE3)和质粒pET28a (+)由实验室保存。
1.1.3 培养基改良LB培养基(g·L-1)：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，pH值7.5，加入终浓度为0.1 mmol·L-1CoCl2。固体培养基加入琼脂粉20.0 g。
磷酸盐缓冲液(PBS，50 mmol·L-1，pH=7.5)：NaH2PO4·2H2O 1.25 g，Na2HPO4·12H2O 15.04 g。
氯霉素母液(Chl，34 mg·mL-1)：称1 g氯霉素溶于29.4 mL无水乙醇，过滤除菌。
卡那霉素母液(Kan，30 mg·mL-1)：称0.75 g卡那霉素溶于25 mL无菌水，过滤除菌。
诱导剂异丙基硫代半乳糖苷母液(IPTG，100 mmol·L-1)：称2.38 g IPTG溶于100 mL无菌水中，过滤除菌，分装于1.5 mL离心管中，-20 ℃条件下储存备用。
1.2 试验方法 1.2.1 En. meliloti 1021静息细胞降解苯甲腈和苯甲酰胺用无菌接种环挑取-80 ℃条件下保藏的En. meliloti 1021，在LB固体平板上4区划线，于恒温培养箱中30 ℃倒置培养至长出单菌落。挑取单菌落接种到含3 mL液体LB培养基的试管中，30 ℃、200 r·min-1培养24 h。按φ=1%的接种量接种到200 mL LB培养基中，30 ℃、200 r·min-1摇床培养12 h。用50 mL离心管收集菌液(OD600=5.0)，4 ℃，以8 000 r·min-1离心5 min(离心半径为10.8 cm)，弃去上清液，用PBS清洗菌体2次，向清洗好的菌体中加入15 mL PBS，涡旋振荡混匀，平均分到3个50 mL离心管中，然后加入终浓度为9.7 mmol·L-1苯甲腈；同样的方式收集菌体，然后加入1.6 mmol·L-1苯甲酰胺转化液；设置底物对照(底物+转化液)和菌体对照(菌体+转化液)，保鲜膜封口并留1个小孔，在每次取样前需补足转化过程中蒸发掉的水分。取样1 mL，以12 000 r·min-1离心10 min(离心半径为7.7 cm)，上清液用乙腈(终止反应)稀释10倍。经0.22 μm孔径的滤膜过滤后用高效液相色谱仪(HPLC)分析。
1.2.2 生物信息学分析在美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)上检索En. meliloti 1021的全基因组(NC_003047.1)，分别搜索腈水合酶(nitrile hydratase)、酰胺酶(amidase)和腈水解酶(nitrilase)，下载相关序列。搜索苯甲酰胺水解酶(benzamide amidase或benzamide amidohydrolase)蛋白序列并下载，用MEGA 6.0软件、Neighbor-joining法构建苯甲酰胺水解酶的系统发育树并进行聚类分析。
1.2.3 En. meliloti 1021腈水合酶和酰胺酶的克隆表达PCR扩增所用引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表 1，引物上含EcoRI和XhoI限制性酶切位点。PCR体系为10×LA缓冲液2 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 2 μL，dNTP 2 μL，En. meliloti 1021基因组DNA 2 μL，LA taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 11 μL，上下游引物分别0.4 μL；扩增程序如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性5 s，退火温度58 ℃反应40 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。克隆的目的基因片段用EcoRI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶电泳验证，然后用ClonExpressII一步克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)将目的片段连入含相同酶切位点的pET28a质粒。E. coli Rosetta (DE3)用氯化钙处理成感受态[15]。根据文献[16]报道的方法在E.coli Rosetta (DE3)中进行En. meliloti 1021腈水合酶和酰胺酶的质粒构建。挑取阳性克隆，送南京斯普金生物有限公司测序。
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表 1 文中所用引物 Table 1 PCR primers used in this study |
E.coli Rosetta(DE3)重组菌株用Kan和Chl抗性的LB培养至OD600=0.6~0.7，然后加入终浓度为0.2 mmol·L-1的IPTG，30 ℃诱导6 h(OD600=3)。以8 000 r·min-1离心5 min(离心半径为10.8 cm)，收集菌体，PBS清洗后分别加入97 mmol·L-1苯甲腈和1.6 mmol·L-1苯甲酰胺底物，设置底物对照和菌体对照。取样1 mL，以12 000 r·min-1离心10 min(离心半径为7.7 cm)，苯甲腈样品稀释100倍，苯甲酰胺样品稀释10倍，经0.22 μm孔径滤膜过滤后进行HPLC分析。另外，取5 mL菌液收集菌体，超声破碎后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白表达情况。
1.2.4 重组的过表达菌株对不同底物的转化腈水合酶重组菌株转化杂环的3-氰基吡啶和3-吲哚乙腈，除草剂敌草腈、氟虫腈和溴虫腈，浓度均为9.7 mmol·L-1；酰胺酶重组菌株转化杂环的烟酰胺和3-吲哚乙酰胺，芳香族的苯乙酰胺，脂肪族的丙烯酰胺和乙酰胺，浓度均为1.6 mmol·L-1。用50 mL离心管收集5 mL诱导至OD600=3的重组菌株，PBS清洗2次，然后加入5 mL相应的底物，30 ℃，200 r·min-1进行转化。腈类底物密封离心管口转化15 min，每隔5 min取样；酰胺类底物转化5 h，每隔1 h取样；样品以12 000 r·min-1离心10 min(离心半径为7.7 cm)，上清液稀释适当倍数，经0.22 μm孔径的微孔滤膜过滤后HPLC分析。腈水合酶酶活定义为每分钟生成1 μmol酰胺产物所需的细胞液的量为1个NHase活力单位(U)。
1.3 HPLC分析采用安捷伦1200型高效液相色谱仪进行分析。HPLC条件：Agilent HC-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；进样体积为20 μL，柱温为30 ℃，检测器为Agilent G1314A紫外检测器；流动相A为经0.22 μm孔径滤膜过滤的双蒸水，然后加入φ=0.1‰色谱级乙酸，流动相B为色谱级乙腈；A和B的比例见表 2，流速为1 mL·min-1，数据由Agilent Chem-station工作站自动采集。
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表 2 底物的HPLC分析条件 Table 2 HPLC conditions for the substrates used in this study |
由图 2可知，以苯甲腈为底物时，24 h之前培养液中检测到苯甲腈和苯甲酰胺，在12 h苯甲酰胺的产量达到最高为4.35 mmol·L-1，24 h之后苯甲酰胺含量降低，并且检测到苯甲酸的产生，72 h时苯甲酸的产量达1.11 mmol·L-1。以苯甲酰胺为底物时，En. meliloti 1021可将苯甲酰胺代谢为苯甲酸，转化72 h，苯甲酸产量为1.51 mmol·L-1且有增加的趋势(图 2)。
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图 2 Ensifer meliloti 1021静息细胞对苯甲腈和苯甲酰胺的降解过程 Fig. 2 Time course of benzonitrile and benzamide degradation by Ensifer meliloti 1021 |
En. meliloti 1021以苯甲腈为底物可产生苯甲酰胺和苯甲酸，以苯甲酰胺为底物可产生苯甲酸；查找En. meliloti 1021的全基因组(NC_003047.1)发现没有腈水解酶(nitrilase)基因，因此确定苯甲腈的降解途径是由腈水合酶和酰胺酶完成。微生物体内的腈水合酶和酰胺酶通常情况下共表达完成生物转化[17]，很多研究已报道这2种腈转化酶对腈类的代谢，例如，对脂肪族乙腈[18]及丁腈[10, 19]等的降解，对芳香族腈类的转化中以3-氰基吡啶居多[20-21]；对降解芳香族苯甲腈的报道很少[22]，BRANDÁO等[23]曾报道过放线菌属(Actinomycetes)腈水合酶对苯甲腈的转化，但转化率比其他腈类低。
2.2 腈水合酶的克隆表达及其表达菌株降解苯甲腈用引物Nha-F和Nha-R扩增获得基因长度1 671 bp的En. meliloti 1021腈水合酶基因序列，包括3个基因：α亚基基因(642 bp)、β亚基基因(660 bp)和激活蛋白基因(387 bp)，其中α亚基和β亚基有4 bp的ATGA重叠序列，β亚基和激活蛋白有14 bp的TTGAACACGCTTAG重叠序列。3个亚基编码的蛋白分子量分别为21、23和14 kDa，等电点为5.45。表达蛋白中激活蛋白没有明显的条带(图 3)，这可能是由于激活蛋白位于α亚基和β亚基下游，与T7启动子序列相隔较远，虽然激活蛋白的表达量低，但是对腈水合酶的活性有极大的促进作用[24]。En. meliloti 1021腈水合酶异源表达菌株在5 min之内将97 mmol·L-1的苯甲腈转化为58.6 mmol·L-1苯甲酰胺，降解率达90%，10 min苯甲腈基本检测不到，生成66.9 mmol·L-1苯甲酰胺，降解效果比一些未经改造的微生物酶解和化学法消除苯甲腈更佳[2, 25-26]。
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M—116，66.2，45，35，25，18.4，14.4；1—E. coli Rosetta(DE3)- pET28a-腈水合酶全蛋白；2—E. coli Rosetta(DE3)-pET28a-腈水合酶可溶性蛋白；3—E. coli Rosetta(DE3)-pET28a全蛋白；4—E. coli Rosetta(DE3)-pET28a可溶性蛋白。 图 3 SDS-PAGE分析Ensifer meliloti 1021腈水合酶 Fig. 3 SDS-PAGE of Ensifer meliloti 1021 NHase gene cluster over-expressed in Escheriachia coli Rosetta(DE3) |
将En. meliloti 1021基因组中的酰胺酶与Genbank中检索到的苯甲酰胺水解酶蛋白序列构建系统发育树(图 4)。
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图 4 Ensifer meliloti 1021酰胺酶的系统进化树 Fig. 4 Neighbor-joining phylogenetic tree of Ensifer meliloti 1021 amidase |
选择与3个苯甲酰胺水解酶(BAJ23981.1、BAJ23976.1和BAJ23974.1)亲缘关系近的登录号为AAK65414.1、CAC47672.1、CAC41593.1和AAK65936.1的酰胺酶进行基因克隆和表达，用Ami1引物克隆的CAC47672.1酰胺酶诱导表达后具有苯甲酰胺酶活性，该酰胺酶有434个氨基酸组成，分子量约47 kDa，等电点为5.37。
异源表达的酰胺酶转化1.6 mmol·L-1苯甲酰胺时，4 h产生的苯甲酸为13.3 nmol·L-1，而对照组含空载质粒的E. coli Rosetta未能检测到苯甲酸的生成。SDS-PAGE显示苯甲酰胺酶的可溶性低，通过降低诱导温度(由30降至20 ℃)和诱导剂浓度(由0.2降至0.1 mmol·L-1)，以及将pET28a更换为pET32a质粒，其可溶性并未得到改善，进一步采用变性和复性的方式纯化包涵体，蛋白可溶性有所提高(图 5)，但是纯化蛋白未能检测到活性。目前，Rhodococcus sp. R312和R. erythropolis AJ270中的酰胺酶异源表达菌株对苯甲酰胺有活性，其中E. coli BL21(DE3)表达的R. erythropolis AJ270酰胺酶在LB培养基中培养，重组菌株最高酶活为2.45 U·mL[12]。有关苯甲酰胺酶的表达仍需进一步优化，以提高蛋白的可溶性和酶活性。
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M—116，66.2，45，35，25，18.4，14.4；1—E. coli Rosetta(DE3)-pET28a全蛋白；2—E. coli Rosetta(DE3)-pET28a可溶性蛋白；3—E. coli Rosetta(DE3)-pET28a-酰胺酶全蛋白；4—E. coli Rosetta(DE3)-pET28a-酰胺酶可溶性蛋白；5—20 ℃诱导E. coli Rosetta(DE3)-pET28a-酰胺酶全蛋白；6—20 ℃诱导E. coli Rosetta(DE3)-pET28a-酰胺酶可溶性蛋白；7—0.1 mmol·L-1IPTG诱导E. coli Rosetta(DE3)-pET28a-酰胺酶全蛋白；8—0.1 mmol·L-1IPTG诱导E. coli Rosetta(DE3)-pET28a-酰胺酶可溶性蛋白；9—E. coli Rosetta(DE3)-pET32a-酰胺酶全蛋白；10—E. coli Rosetta(DE3)-pET32a-酰胺酶可溶性蛋白；11—镍柱纯化的包涵体内酰胺酶。箭头处为目的蛋白。 图 5 SDS-PAGE分析Ensifer meliloti 1021酰胺酶 Fig. 5 SDS-PAGE of Ensifer meliloti 1021 amidase gene over-expressed in Escheriachia coli Rosetta(DE3) |
HPLC分析E. coli Rosetta(DE3)腈水合酶重组菌株除降解苯甲腈外，还可转化3-吲哚乙腈和3-氰基吡啶，但对敌草腈、溴虫腈和氟虫腈没有降解活性。表达的腈水合酶对3-吲哚乙腈的相对酶活性为14.5%(苯甲腈的腈水合酶酶活定义为100%)，对3-氰基吡啶相对酶活为318%。含酰胺酶的E. coli Rosetta(DE3)重组菌株可代谢苯甲酰胺，对以上提到的其他几种含酰胺基团的化合物均无活性，这与R. erythropolis AJ270酰胺酶的异源表达菌株具有宽泛的底物选择性不同[12]。
3 结论(1) En. meliloti 1021可降解苯甲腈生成苯甲酰胺和苯甲酸，其降解途径中的酶系为腈水合酶-酰胺酶。
(2) 腈水合酶过表达的E. coli可在5 min内降解90%的浓度为97 mmol·L-1的苯甲腈，反应10 min后基本上检测不到苯甲腈的存在，产生66.9 mmol·L-1苯甲酰胺。
(3) 通过系统进化树分析筛选并克隆和表达了En. meliloti 1021代谢苯甲酰胺的酰胺酶，该酶具有严格的苯甲酰胺底物特异性。
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