2. 西南野生动植物保护重点实验室/西华师范大学生命科学学院, 四川 南充 637002;
3. 西昌学院农业科学学院, 四川 西昌 615000
2. Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation/College of Life Sciences, China West Normal University, Nanchong 637002, China;
3. College of Agriculture Science, Xichang College, Xichang 615000, China
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是广泛存在于环境中的含有2个及以上苯环的一类持久性有机污染物[1]，通过干湿沉降、污泥农用和污水灌溉等方式在土壤表面不断累积[2]，使土壤成为PAHs重要的载体之一。PAHs进入土壤后发生的一系列物理化学过程，如吸附、迁移、转化和降解等，是PAHs在土壤中消减的主要途径[3]。对PAHs土壤污染的研究主要集中在工业用地、城市区域[4]。近些年农业用地的PAHs污染也逐渐受到关注[4]。其中，水稻种植是我国主要的耕种方式之一，然而对我国不同区域水稻土壤中PAHs污染的降解响应过程研究仍十分有限。
土壤理化性质，如pH值、有机质含量、通气性、盐度、含水量等都会影响土壤中PAHs的降解过程[5-6]。对芘在土壤中吸附行为的研究结果表明，有机质含量越高，芘的不可逆吸附越强[7]，直接影响PAHs的生物可利用性。有机质组分不同的土壤吸附PAHs的能力有很大差异[8]，KE等[9]研究发现吸附在极性有机质上的PAHs更容易被降解。土壤环境差异造成土壤微生物地理分布不同[10]，使得不同类型土壤中PAHs的生物降解率可能有显著差异。此外，PAHs污染造成土壤中碳源急剧增加，使氮和磷等营养物质元素常常成为限制PAHs生物降解的主要因素[11]。由于不同类型土壤中含水量、土壤质地存在差异，由此形成的不同微环境氧气浓度也是PAHs降解率的影响因素之一。此外，PAHs浓度和化学结构也是影响其在土壤中降解的重要因素之一[12]。NAM等[13]发现，高分子量PAHs比低分子量PAHs更容易被土壤有机质吸附。此外，土壤微生物的改变是污染土壤生态环境中微生物活性的敏感指示。丁克强等[14]研究发现菲能刺激土壤中细菌生物量增加10倍以上。
由于发育母质和气候条件等不同，我国从北到南形成了不同的土壤地带谱。笔者在我国采集了8种稻田土壤，通过向土壤中添加菲、荧蒽和苯并[a]蒽等不同环数PAHs在室内模拟土壤PAHs污染，探究不同类型稻田土壤中PAHs降解率的差异，并初步分析土壤理化性质和PAHs降解率的关系，为探究我国不同类型稻田土壤PAHs积累消减机制以及区域稻田土壤生态风险预测和评价提供依据。
1 材料与方法 1.1 供试土壤于2016年11月分别采集重庆长寿区中性紫色土(CQ)、湖南吉首市黄壤(HuN)、黑龙江佳木斯市黑土(HLJ)、安徽淮南市黄褐土(AH)、河南周口市潮土(HeN)、北京市潮土(BJ)、四川南充市石灰性紫色土(SC)和山西长治市褐土(SX)8个水稻种植区土壤样品(表 1)。采用网格布点法分别采集50 m×50 m范围内表层土壤(0~10 cm)，混合均匀，去除植物根系、石砾等，过2 mm孔径不锈钢筛，置于4 ℃冰箱内保存以备后续培养实验。取部分土壤样品自然风干后过0.90 mm孔径筛，用于土壤理化性质测定。
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表 1 采样点信息 Table 1 Sampling sites information |
采用酸度计测定土壤pH值〔m(土) :V(水)=1 :2.5〕，采用称重法测定土壤含水量，采用重铬酸钾氧化-外加热法测定土壤有机质，采用全自动间断化学分析仪(Skalar，Breda，荷兰)测定土壤铵态氮、硝态氮和总氮含量。
8种稻田土壤基本理化性质见表 2。有机质含量有显著差异(P＜0.05)，其中HLJ有机质含量最高，是含量最低的CQ的2.3倍，这可能是由于土壤母质和耕种施肥不同所致[15]。不同类型稻田土壤中总氮、硝态氮和铵态氮含量也有显著差异。由表 2可知，HLJ为强酸性，HuN为弱酸性，其余土壤均为碱性。土壤含水量相差很大，SC含水量最高，是含水量最低的BJ的7倍。
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表 2 土壤基本理化性质 Table 2 Soil physicochemical properties |
分别取50.0 g(干土重)新鲜土壤(HLJ、BJ、SX、HeN、AH、CQ、SC和HuN分别为59.5、55.5、59.5、57、56.5、64.0、91.0和61.5 g)放入灭菌玻璃培养皿中，加入菲、荧蒽和苯并[a]蒽混合丙酮溶液，使土壤中菲、荧蒽和苯并[a]蒽含量分别为2 μg·g-1。将玻璃培养皿置于通风厨中，使丙酮溶剂充分挥发后，再于25 ℃条件下自然光中培养，好氧条件含水量为饱和持水量的50%~65%。分别在第0、7、17和28 d采集土壤样品，用于测定PAHs含量和土壤理化性质。
1.4 分析测试土壤中PAHs含量采用气相色谱-质谱法测定：称取冷冻干燥土样2.0 g与等体积无水硫酸钠(400 ℃条件下烘干8 h)混匀，用滤纸包好放入索氏提取仪中，加入80 mL二氯甲烷在45 ℃条件下连续提取24 h后放入旋转蒸发器(BUSHI，瑞士)中浓缩，添加2 mL正己烷溶解。选内径1 cm、高20 cm玻璃层析柱，采用10 mL正己烷湿法装入1 g硅胶，取2 ml溶液通过层析柱，并用V(正己烷) :V(二氯甲烷)=1 :1洗脱，洗脱液于氮吹仪(北京帅恩科技有限责任公司)上浓缩为1 mL，用正己烷定容至2 mL后采用气相色谱质谱联用仪(7890 GC system-240 Ion Trap，Agilent，美国)测定。
标准品菲、荧蒽、苯并[a]蒽购自Sigma-Aldrich公司，标准储备液采用正己烷配置。色谱柱和质谱条件参照文献[16]。
1.5 土壤中PAHs降解率和降解速率的计算土壤中PAHs降解率计算公式为
| $ {R_n} = ({m_0}-{m_n})/{m_0} \times 100\% 。$ | (1) |
式(1)中，Rn为培养n天时土壤中PAHs降解率，%；m0为培养零时刻时土壤中PAHs总量，ng；mn为第n天时土壤中PAHs总量，ng。
每个时段土壤中PAHs降解速率计算公式为
| $ {V_{r, n}} = ({c_n} - {c_r})/{t_{r, n}}。$ | (2) |
式(2)中，Vr，n为培养第n到r天PAHs在土壤中的平均降解速率，ng·g-1·d-1；cn和cr分别为土壤培养n和r天时土壤中PAHs质量含量，ng·g-1；tr，n为第n到r天的时间，d。
1.6 土壤总DNA提取与荧光定量PCR分析分别于培养0、7和28 d时取0.6 g(干土重)土壤用于提取土壤中微生物总DNA。土壤DNA提取采用FastDNATM SPIN Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals，美国)提取。DNA浓度采用紫外可见分光光度计(NanoDrop 2000，美国)测定。
实时荧光定量PCR扩增分析采用SYBR®Premix EX TaqTM试剂盒(Tli RNaseH Plus)在荧光定量PCR仪(CFX96 Optical Real-Time PCR System，Bio-Rad Laboratories，美国)上进行。实时荧光定量PCR的标准曲线采用向载体质粒中分别导入含有细菌16S rRNA基因和菲降解双加氧酶基因phnAc的克隆子制备，将含有目标基因的克隆子在液体培养基中培养过夜，使用MiniBEST Plasmid Purification Kit试剂盒(Takara)进行质粒提取和纯化后，采用分光光度计测定DNA浓度，并结合质粒的分子质量计算其拷贝数。对质粒标线按10倍梯度稀释，得到7个数量级的标准曲线，其标准曲线质粒浓度变化范围为102~108拷贝·L-1。定量PCR的反应体系为20 μL，包括10 μL SYBR©Premix EX TaqTM (Tli RNaseH Plus)、1 μL DNA模板和正向、反向引物各0.1 μL(引物浓度10 μmol·L-1)和8.8 μL灭菌双蒸水。阴性对照用灭菌双蒸水代替样品模板。实验中所使用的引物见表 3[17-18]。
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表 3 实时荧光定量PCR扩增引物及反应条件 Table 3 Primers and conditions used in the study |
所有处理均设3个重复，Duncan多重比较分析采用SPSS 20.0软件，PAHs和各环境因子变化相关性冗余分析(redundancy analysis，RDA)采用Canoco 4.5软件，制图采用Origin 8.1软件。
2 结果与讨论 2.1 PAHs对土壤中总细菌数量和phnAc基因数量的影响8种类型稻田土壤总细菌数量在不同培养时段为3.89×109~1.07×1012拷贝·L-1(图 1)。而特异参与菲降解的双加氧酶对应的功能基因phnAc在不同培养时段为4.27×105~6.48×107拷贝·L-1(图 1)。结果显示，不同类型稻田土壤微生物数量差异显著，添加PAHs后，除CQ和SC外微生物数量显著变化(P < 0.05)，说明PAHs对微生物从数量上没有毒性作用。添加菲后，除CQ、SC和AH外，其他5种土壤培养7 d内phnAc基因数量显著增加(P < 0.05)，表明菲降解微生物数量在菲的刺激下有所增加。这说明PAHs对土壤中降解微生物的生长有促进作用，这与BLAKELY等[19]研究结果一致。低环PAHs(2~3环)比高环PAHs更容易引起微生物群落结构改变，以适应PAHs污染胁迫[20]。所以，在土壤中添加菲、荧蒽和苯并[a]蒽后，能特异参与菲降解的双加氧酶所对应的功能基因phnAc数增加，说明微生物在PAHs的降解中有重要贡献。然而，复杂的土壤生态环境中PAHs的消除是一个生物和非生物因素共同作用的结果，尤其低环PAHs的消除受挥发、水解等物理化学因素影响较大，仍需进一步探究。
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图 1 8种稻田土壤基于16S rRNA基因所测定的总细菌数量和phnAc基因数量随时间的变化 Figure 1 Changes of the copy number of bacterial 16S rRNA gene and phnAc gene in 8 paddy soils incubated with PAHs HLJ为黑龙江佳木斯市黑土，BJ为北京市潮土，SX为山西长治市褐土，HeN为河南周口市潮土，AH为安徽淮南市黄褐土，CQ为重庆长寿区中性紫色土，SC为四川南充市石灰性紫色土，HuN为湖南吉首市黄壤。直方柱上方英文小写字母不同表示不同类型土壤之间某指标差异显著(P < 0.05)。 |
PAHs进入土壤后可通过挥发、光氧化、化学氧化、生物积累、土壤吸附和微生物降解等去除方式降低含量[21]。PAHs在不同土壤中降解受到如PAHs和土壤理化性质等多种因素影响。8种稻田土壤中菲、荧蒽和苯并[a]蒽3种PAHs降解率和降解速率随时间变化情况见图 2和表 4。
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图 2 8种稻田土壤中菲、荧蒽和苯并[a]蒽降解率随时间变化 Figure 2 Changes of the degradation ratio in the incubation experiments with phenanthrene, fluoranthene and benzo[a] anthracene of different paddy soils HLJ为黑龙江佳木斯市黑土，BJ为北京市潮土，SX为山西长治市褐土，HeN为河南周口市潮土，AH为安徽淮南市黄褐土，CQ为重庆长寿区中性紫色土，SC为四川南充市石灰性紫色土，HuN为湖南吉首市黄壤。直方柱上方英文小写字母不同表示不同类型土壤之间某指标差异显著(P < 0.05)。 |
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表 4 土壤中PAHs降解速率随时间变化 Table 4 Degradation rate of polycyclic aromatic hydrocarbons in different periods of incubation |
不同类型土壤中菲、荧蒽和苯并[a]蒽的降解率有很大差异。8种稻田土壤中菲平均降解率在培养7、21和28 d时分别为62.70%、80.43%和94.71%，荧蒽在3个时间点的平均降解率为54.29%、75.89%和94.08%，而苯并[a]蒽在3个时间点的平均降解率为37.44%、64.31%和83.69%。PAHs降解率由大到小依次为菲、荧蒽和苯并[a]蒽。这可能是由于3种PAHs的水相溶解度、辛醇-水分配系数和亨利常数等理化性质不同所致。菲的水相溶解度最高，为1.24 mg·L-1，其次为荧蒽，为0.25 mg·L-1，苯并[a]蒽最低，为0.01 mg·L-1[22]，即菲在土壤中的生物可利用态最高，而生物降解是PAHs降解的主要途径。因此，菲的生物易降解性好是降解率高的主要原因。28 d后，3环的荧蒽降解率比4环的苯并[a]蒽平均高10.4%。LUKIĆ等[23]研究结果表明土壤中3环PAHs降解率比4环PAHs甚至高30%。
7 d时，HuN和AH中菲降解率分别为33.9%和45.6%，显著低于其他5种土壤(P < 0.05)。21 d时，土壤中菲降解率均高于75%。SC、CQ和HLJ中菲降解速率最高，7 d时降解率分别达82.76%、78.25%和76.08%，菲平均降解速率在前7 d分别为87.72、110.84和182.94 ng·g-1·d-1。28 d后，菲降解率都达92%以上。7 d时，HLJ和CQ中荧蒽降解率最高，分别为70.19%和76.23%；SC、BJ和AH中荧蒽降解率最低，分别为40.5%、43.3%和44.4%。28 d后荧蒽降解率均达97%以上。7 d时，AH中苯并[a]蒽降解率仅为24.78%，HLJ和CQ中降解率最高，分别为51.29%和48.35%。21 d时，CQ和HLJ中苯并[a]蒽降解率分别为90.64%和90.44%，SC中为75.62%，其余均低于60%。28 d时，除HuN中苯并[a]蒽降解率为56.87%外，其他均达70%以上。
土壤中菲、荧蒽和苯并[a]蒽降解主要发生在前7 d。PAHs降解速率随含量降低也显著降低。如前7 d时SC中菲、荧蒽和苯并[a]蒽降解速率分别是后21 d降解速率的16.1、2.2和2.4倍。该结果与KUPPUSAMY等[24]发现的4环及以下PAHs在土壤中降解行为曲线一致，表明土壤中生物和非生物途径能快速对污染物做出响应。
2.3 影响土壤PAHs降解的环境因素8种稻田土壤中菲、荧蒽和苯并[a]蒽降解率与7个环境因子的RDA分析结果见图 3。
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图 3 不同稻田土壤对PAHs的降解行为与环境因子的冗余分析 Figure 3 Redundancy discrimination analysis(RDA) of the relationship between the soil physicochemical parameters, sampling site and the degradation behavior of different paddy soils HLJ为黑龙江佳木斯市黑土，BJ为北京市潮土，SX为山西长治市褐土，HeN为河南周口市潮土，AH为安徽淮南市黄褐土，CQ为重庆长寿区中性紫色土，SC为四川南充市石灰性紫色土，HuN为湖南吉首市黄壤。箭头表示变量方向和大小。 |
图 3显示，AH和HuN分布在第1象限，HLJ和CQ在第2象限，BJ、SX和HeN在第3象限，SC在第4象限，PAHs在同一象限稻田土壤中降解特征较相似，同时也表明PAHs在不同类型土壤中降解行为有差异。
RDA分析对7个环境因子进行评估，从中提取2组主成分因子，以分析环境因子对PAHs降解行为的影响。影响土壤PAHs降解速率的第1排序轴和第2排序轴特征值分别为71.6%和14.6%，可以解释降解速率差异总方差值的86.2%，说明这2个排序轴能够真实反映环境因子对PAHs降解速率的影响。第1排序轴表明，影响土壤中PAHs降解的主要环境因子为w(有机质)(得分为0.49)、含水量(得分为0.44)、w(TN)(得分为0.37)、w(NO3--N)(得分为-0.28)、pH值(得分为-0.25)、w(NH4+-N)(得分为-0.22)和海拔(得分为0.13)。第2排序轴中主要环境因子为pH值(得分为-0.73)、w(NO3--N)(得分为-0.25)、海拔(得分为-0.32)、含水量(得分为-0.26)、w(TN)(得分为0.24)、w(有机质)(得分为-0.01)和w(NH4+-N)(得分为-0.01)。结果表明，土壤基本理化性质等环境因子不同可能是造成土壤中PAHs降解行为差异的原因[23]。
相关性分析显示土壤中菲和荧蒽降解行为显著相关(P < 0.05，表 5)，这可能是由于菲和荧蒽都含有3个苯环，在土壤中留存时间和吸附-降解行为相似[25]。菲和荧蒽的降解速率与pH值和含水量呈负相关，与海拔以及NO3--N、NH4+-N、有机质和全氮含量呈正相关，其中土壤中菲降解速率与有机质含量呈显著正相关(P < 0.05)，荧蒽降解速率与NH4+-N含量呈显著正相关(P < 0.05)。PAHs在土壤中长期滞留通常是由于被土壤有机质吸附，进入土壤微空隙中，从而影响PAHs生物有效性[26]。
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表 5 土壤中PAHs降解速率与环境因子的相关性分析 Table 5 Pearson correlation between soil PAHs degradation rate, soil chemical properties and sampling site altitude |
该研究中有机质含量却与3种PAHs降解呈正相关，这可能是由于稻田土壤会施用有机肥，而有机肥是土壤中降解微生物类群主要营养来源，能促进土壤中微生物整体活性。LUKIĆ等[27]研究发现向PAHs污染土壤中添加牛粪、污泥和厨房有机残渣等有机成分后，PAHs去除率分别提高40%、33%和26%。NH4+-N含量与荧蒽降解呈正相关，是因为当有机污染发生时，碳源急剧增加，会加速土壤中微生物对氮、磷等元素的需求[28]。JONER等[29]研究也发现加入氮源等营养元素，可显著提高3环和4环PAHs降解率。
pH值是影响PAHs降解的主要原因之一，PAHs降解一般发生在pH值为5.0~9.0时，中性条件下生物降解率最高[30]。ZAIDI等[31]研究发现pH值大于8时，菲生物降解过程被显著抑制。同时pH值也可通过影响PAHs在土壤溶液中的溶解性来影响PAHs的生物可降解性[32]。
苯并[a]蒽在土壤中降解与7个环境因子均无显著相关性(P>0.05)。苯并[a]蒽与菲和荧蒽在水溶性和生物可利用性上的差异，也是导致其与环境因子间相关性差异的主要原因。此外，3种PAHs降解率均与土壤含水量呈负相关。VIDALI[33]提出有利于有机污染物降解的土壤最佳含水量应为土壤饱和持水量的30%~90%。含水量过高会造成土壤微环境中氧浓度降低，形成厌氧环境，抑制PAHs的好氧氧化过程。由以上分析可知，土壤环境因子会影响土壤中PAHs降解过程和留存时间，土壤中PAHs降解和吸附行为由多种土壤理化性质和其他环境条件综合决定。
3 结论(1) 不同类型稻田土壤中PAHs降解率有差异，7 d时菲、荧蒽和苯并[a]蒽降解率分别为62.70%、54.29%和37.44%，28 d后降解率均达80%以上。不同类型稻田土壤中PAHs降解率由大到小依次为SC、HLJ、CQ、SX、BJ、AH、HeN和HuN。PAHs在不同类型土壤中环境行为有差异。
(2) 不同类型稻田土壤微生物量有显著差异，除CQ和SC外，PAHs污染能促进微生物数量显著变化(P < 0.05)。除CQ、SC和AH外，参与菲降解的双加氧酶功能基因phnAc在其他5种土壤中均显著增加(P < 0.05)。
(3) 稻田土壤与菲和荧蒽的降解行为显著相关，含4个苯环的苯并[a]蒽的降解速率显著低于含4环以下PAHs的降解速率。这3种典型PAHs易降解程度由大到小依次为菲、荧蒽和苯并[a]蒽。
(4) 稻田土壤中PAHs降解速率受土壤和PAHs理化性质的综合影响。菲和荧蒽降解速率与土壤总有机质和NH4+-N含量呈显著正相关(P < 0.05)，与土壤pH值和含水量呈负相关。苯并[a]蒽降解速率与研究中土壤环境因子无显著相关性(P>0.05)。
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