2. 南京工业大学环境学院, 江苏 南京 210009
2. College of Environment, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China
壬基酚(nonylphenol, NP)是一种重要的化工原料和中间体, 属于酚类抗氧化剂, 它被广泛应用于非离子表面活性剂、农药乳化剂和改性酚醛树脂等生产中。在美国, 壬基酚年消费量达到154 200 t, 欧洲年使用量为73 500 t, 我国壬基酚的年使用量为1 600 t[1]。据报道, 我国水库和河流表层水体中已检测到壬基酚, 且质量浓度已达30.05~288.75 μg·L-1[2]。壬基酚化学性质稳定, 不易降解, 具有类雌激素作用, 对生物有累积作用和致突变性[3], 壬基酚现已被联合国环境保护署列为需优先控制的持久性污染物之一[4]。4-壬基酚是工业NP主要的异构体组成成分, 4-NP是包括p353-NP、p363-NP、p33-NP等至少20种异构体的混合物[5-6]。在已有的的研究报道中, 4-壬基酚暴露对水生生物、陆生生物及人类健康均有不同程度的影响[7-9]。
鱼类胚胎在发育初期对污染物毒性反应十分灵敏, 因而鱼类胚胎毒性测试被广泛应用于环境毒理学研究中[10]。其中, 斑马鱼(Danio rerio)作为模式生物, 被广泛运用于早期胚胎发育的基因表达控制、化学混合物的急慢性毒性检测和重金属的生物累积效应研究[11-13]中。目前, 4-壬基酚对生物毒性的研究还鲜有报道。笔者研究了4-壬基酚对斑马鱼胚胎发育的毒性, 以了解其对鱼类的生态毒理效应, 为评价该类环境激素产生的环境风险提供基础实验数据和理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料与仪器试剂:4-壬基酚, (CAS:25154-52-3, 纯度w≥98%), 乙醇(CAS:64-17-5, 南京化学试剂有限公司, 分析纯)。
仪器:体视显微镜(Leica S8APO)、人工气候培养箱(宁波江南仪器厂RXZ-280D)、微量移液枪(Eppendorf)、6孔细胞培养板等。
1.2 供试生物的准备供试AB品系斑马鱼购自南京大学模式生物研究中心, 并在环境保护部南京环境科学研究所斑马鱼实验系统中心驯养2周以上, 驯化温度为(25±2) ℃。实验前1 d, 挑选腹部膨胀且能看到生殖孔突出的8尾雌斑马鱼和外观正常、个体均匀、反应灵敏健康的8尾雄斑马鱼, 按雌雄鱼数量1：1的比例分别放入4个繁殖盒中, 保持繁殖盒中水温为(26±1) ℃, 将繁殖盒放置在黑暗处, 早晨用微弱的光线促进其产卵。2~4 h后, 收集鱼卵, 在显微镜下挑选正常发育的受精卵用去离子水冲洗3次, 用于暴露实验。
1.3 溶液的配制与浓度设置以乙醇为助溶剂配制4-壬基酚母液:ρ=500 mg·L-1, φ=22%。将4-壬基酚母液配制成不同质量浓度的测试液:2.0、5.0、10.0、25.0、50.0、125.0 μg·L-1。根据最低处理浓度组校准加入实验体系的其他处理组溶液, 使不同处理组外来溶液体积相同, 同时, 空白对照组加入相同体积的水。实验中φ(乙醇)≤0.005 5%。乙醇染毒斑马鱼胚胎试验表明, φ=0.005 5%的乙醇对胚胎发育无影响。因此, 空白对照组采用相同体积的曝气48 h以上的自来水。
1.4 暴露处理暴露实验所采用的研究方法依照GB/T 21807—2008[14], 设置4-壬基酚处理组和空白对照组, 每个浓度设3组平行, 每组平行30枚受精卵。以6孔细胞培养板作为培养容器, 每孔中加入10 mL测试液和5枚受精卵。将6孔细胞培养板置于光照培养箱中, 控制温度为(26.0±0.5) ℃, 光照时间为t(日)：t(夜)=14 h：10 h。每隔24 h需更换1次测试液, 实验所用水为曝气48 h以上的自来水。实验过程中应及时挑出死亡胚胎及仔鱼, 避免对其他胚胎造成影响。
每天通过体视显微镜观察其生长状况, 记录并统计相关数据:(1) 记录24、48、72、96和120 h死亡数, 计算死亡率:死亡率=死亡数/30×100%;(2) 统计72 h孵化数:孵化率=孵化数/30×100%;(3)24 h尾部畸形率:尾部畸形率=尾部畸形数/24 h各平行存活数×100%;(4)96 h仔鱼的心包囊肿率:心包囊肿率=患心包囊肿的幼鱼数/96 h各平行存活数×100%;(5)96 h仔鱼的30 s心跳数及体长。
1.5 统计分析采用SPSS 19.0统计软件probit模块计算LC50。对于效应值的显著性分析, 在满足正态分布(Shapiro-Wilk test)和方差齐性(Levene′s test)的前提下, 采用方差分析(ANOVA)和多重比较(S-N-K test)分析处理之间的差异显著性, 否则，采用非参数检验(Kruskal-Wallis test)来检验处理之间的差异显著性, P＜0.05表示具有显著差异, P＜0.01表示具有极显著差异, 用Origin 8.5软件作图。
2 结果与分析 2.1 4-壬基酚对斑马鱼胚胎/仔鱼的致死效应随着暴露时间的增加, 4-壬基酚处理组斑马鱼胚胎死亡率不断增加, 呈现剂量-时间效应(图 1)。
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图 1 不同浓度4-壬基酚处理120 h内斑马鱼胚胎/仔鱼死亡率 Figure 1 Mortality of Danio rerio embryos/larva in 4-NP treatment groups during 120 h *表示P＜0.05,**表示P＜0.01。 |
高浓度组(125.0 μg·L-1)4-壬基酚溶液中斑马鱼胚胎死亡率从暴露48 h开始即出现显著升高(P＜0.01), 暴露120 h时死亡率达95.6%。暴露120 h时, 2.0、5.0、10.0、50.0 μg·L-1组胚胎及仔鱼死亡率较空白对照组均显著增加(P＜0.01)。4-壬基酚对斑马鱼胚胎48、72和96 h的LC50分别为131.4、47.2和26.8 μg·L-1。
2.2 4-壬基酚对斑马鱼胚胎孵化的影响暴露72 h时不同浓度4-壬基酚溶液对斑马鱼胚胎孵化率的影响见图 2。125.0 μg·L-1组斑马鱼胚胎孵化率仅为45.56%, 与对照组相比显著降低, 其他浓度组斑马鱼胚胎孵化率与空白对照组间无显著差异。
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图 2 不同浓度4-壬基酚溶液对斑马鱼孵化率的影响 Figure 2 Effect of a series of concentrations of 4-NP on Danio rerio embryos′ hatching rate **表示P＜0.01。 |
暴露在4-壬基酚溶液中的斑马鱼胚胎及刚孵出的仔鱼出现多种毒性效应(图 3)。
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图 3 4-壬基酚对斑马鱼胚胎/仔鱼生长发育的影响 Figure 3 Effects of 4-NP on the development of Danio rerio embryos/larva A1、A2、A3、A4—正常生长发育的斑马鱼胚胎及仔鱼; B1—暴露至24 h卵凝结胚胎; C1—尾部畸形胚胎; B2、C2—暴露至48 h发育阻滞的胚胎; B3、B4、C3—脊柱弯曲; C4—心包囊肿。 |
暴露24 h时, 各浓度4-壬基酚处理组斑马鱼胚胎都出现明显的中毒症状, 呈现卵凝结(B1) 和胚胎尾部畸形(C1)。暴露48 h时, 出现发育阻滞现象(B2和C2)。暴露72 h时, 新孵仔鱼在不同程度上出现体长缩短、畸形情况(B3、C3)。暴露96 h时, 4-壬基酚处理组斑马鱼仔鱼出现脊柱弯曲(B4) 和心包囊肿(C4) 等现象。
2.4 4-壬基酚对斑马鱼胚胎/仔鱼的致畸效应 2.4.1 4-壬基酚对斑马鱼胚胎尾部畸形的影响暴露24 h时, 通过显微镜能观察到斑马鱼胚胎尾部畸形现象, 且斑马鱼胚胎尾部畸形率随着4-壬基酚浓度的增加而增加, 呈正剂量-效应关系(图 4)。空白组与2.0 μg·L-1处理组间无明显差异, 而与5.0、10.0、25.0、50.0、125.0 μg·L-1处理组间差异极显著(P＜0.01)。
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图 4 暴露24 h后4-壬基酚处理组斑马鱼胚胎尾部畸形率 Figure 4 Abnormal rate of Danio rerio embryos′ tail exposed to a series of concentrations of 4-NP after 24 h **表示P＜0.01。 |
暴露96 h时4-壬基酚处理组斑马鱼仔鱼出现心包囊肿情况(图 5)。暴露在4-壬基酚溶液中的斑马鱼患心包囊肿率显著高于空白对照组, 其中，125.0 μg·L-1处理组斑马鱼心包囊肿率达79.44%。
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图 5 不同浓度4-壬基酚处理组斑马鱼仔鱼心包囊肿率 Figure 5 Rate of Danio rerio larva′s pericardial cyst in a series of concentrations of 4-NP **表示P＜0.01。 |
暴露96 h时, 随机选取对照组和4-壬基酚处理组5尾幼鱼, 分别测量其体长(图 6)及30 s心跳数(图 7)。对照组斑马鱼仔鱼体长(3.84±0.03) mm, 30 s平均心跳数为67.87次, 经4-壬基酚暴露处理的斑马鱼仔鱼体长及30 s心跳数均显著低于对照组(P＜0.05)。
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图 6 不同浓度4-壬基酚对斑马鱼仔鱼体长的影响 Figure 6 Effect of a series of concentrations of 4-NP on body length of Danio rerio larva **表示P＜0.01。 |
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图 7 不同浓度4-壬基酚对斑马鱼仔鱼30 s心跳数的影响 Figure 7 Effect of exposure to a series of concentrations of 4-NP on 30 s′ heart beats of Danio rerio larva **表示P＜0.01。 |
壬基酚作为一种内分泌干扰物, 具有生物富集性, 能稳定存在于水体中, 对鱼类、单细胞藻类、大型溞等具有不同程度的毒性[15]。生物胚胎时期特别是卵生脊椎动物如鱼类, 其胚胎对污染物的敏感性相对于成年个体来说更高[16]。笔者研究发现, 4-壬基酚暴露下斑马鱼胚胎死亡率较高, 其48、72和96 h的LC50分别为131.4、47.2和26.8 μg·L-1, 随着4-壬基酚暴露时间的延长，LC50值降低。前人研究表明, 玫瑰无须鲃(Puntius conchonius)胚胎[17]和金鱼(Carassius auratus)胚胎[18]对壬基酚也有较高的敏感性, 壬基酚对其致死效应显著。壬基酚对斑马鱼胚胎的较高致死效应影响了胚胎孵化率。正常斑马鱼胚胎从受精后48 h开始孵化, 72 h后进入早期幼鱼阶段。125.0 μg·L-1处理组对斑马鱼胚胎的高致死作用使其孵化率显著降低, 其72 h孵化率仅为45.56%。YANG等[19]研究发现50 μg·L-1处理组斑马鱼胚胎卵膜变薄, 使得胚胎更易受到外界污染物的毒害作用, 引起胚胎死亡，进而降低胚胎孵化率。另外, 也有研究表明, 壬基酚会通过抑制孵化酶活性而延迟斑马鱼胚胎的孵化时间, 从而影响胚胎的正常孵化[20-21]。
壬基酚对斑马鱼胚胎的形态学影响主要表现为卵凝结、尾部畸形和心包囊肿等现象, 对出孵仔鱼的影响主要表现为其体长缩短。随着4-壬基酚暴露浓度的增加, 斑马鱼胚胎卵凝结现象越来越严重, 斑马鱼胚胎尾部畸形及心包囊肿等畸形现象逐渐显现, 且胚胎尾部畸形率随4-壬基酚浓度的增加呈正剂量-效应关系。4-壬基酚处理组初孵仔鱼活力较弱, 且2.0 μg·L-1处理组初孵仔鱼体长显著缩短。肖勤等[17]将玫瑰无须鲃受精卵暴露在不同浓度的壬基酚中, 同样观察到胚胎卵凝结、尾部弯曲和脊椎畸形等现象。KINCH等[22]研究发现, 浓度为6.8 nmol·L-1的壬基酚不仅能显著缩短斑马鱼胚胎的体长, 还能缩短斑马鱼胚胎的尾长及头部宽度。因此, 壬基酚对鱼类胚胎发育的毒性效应不容忽视。
4 结论4-壬基酚对斑马鱼胚胎48、72和96 h的LC50分别为131.4、47.2和26.8 μg·L-1。125.0 μg·L-1的4-壬基酚对斑马鱼胚胎的高致死效应使得其孵化率显著降低。另外, 4-壬基酚暴露可显著增加斑马鱼胚胎畸形率, 且随着4-壬基酚暴露浓度的增加, 斑马鱼胚胎畸形率增高, 呈正剂量-效应关系, 畸形现象主要表现在胚胎/仔鱼尾部畸形、心包囊肿和脊柱畸形等方面。与对照组相比, 4-壬基酚处理组斑马鱼仔鱼体长显著缩短, 30 s心跳数显著降低。2 μg·L-1 4-壬基酚即对斑马鱼胚胎具有显著的毒性效应。
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