兽用抗生素因其具有防病、促生长的作用而被广泛应用于畜禽养殖业, 通过口服或肌肉注射进入动物体内的抗生素很少被内脏器官吸收利用, 大部分以原药和代谢产物的形式残留在畜禽粪便中[1-3]。畜禽粪便既是污染源, 同时也是一种可以再次利用的资源。沼气发酵技术作为一项清洁生物质能源技术, 近年来在畜禽粪便等农业废弃物处理方面得到了广泛应用[4]。然而, 残留在畜禽粪便中的抗生素会使沼气发酵的产气效率出现不同程度的下降[5-6]。沼气发酵这一厌氧生物降解过程极其复杂, 沼气发酵是涉及多菌群相互作用的非线性复杂系统, 是厌氧微生物的新陈代谢活动, 不同微生物菌群的代谢过程相互影响、相互制约, 共同影响着厌氧的主要最终产物沼气的产量[7]。沼气发酵过程中微生物群落结构及水解酶活性变化是影响沼气发酵产气效率的关键因素。
磺胺类药物(sulfonamides, SAs)是一种具有对氨基苯磺酰胺结构的合成抗菌药物, 主要用于预防和治疗细菌感染性疾病。它具有抗菌谱广、疗效好、价格便宜等优点, 是我国生产量和使用量最大的兽药之一, SAs可影响核蛋白的合成, 从而抑制细菌的生长与繁殖[8-9]。近年来，我国学者调查发现, 磺胺类药物抗生素在畜禽粪便中的残留达到mg·kg-1级[10-11], 其中，磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine, SMZ)是残留在畜禽粪便中的一种主要磺胺类抗生素。目前, 有关抗生素对土壤酶活性、微生物群落多样性及抗性基因的研究较多[12-13], 而有关磺胺类抗生素对于畜禽粪便沼气发酵过程中酶活性及微生物多样性的影响研究较少。笔者以在畜禽粪便中检出率较高的SMZ为对象, 研究添加不同浓度SMZ对猪粪沼气发酵过程中脲酶、脱氢酶活性及微生物群落功能多样性的影响, 为残留有抗生素的畜禽粪便沼气发酵无害化处理提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 发酵原料发酵原料玉米秸秆取自沈阳农业大学试验基地, 自然风干后剪短至3~5 cm, 经粉碎机粉碎成粉末; 沼气发酵供试粪便采自沈阳农业大学养猪场育成期猪(猪体重40~80 kg)收集的新鲜猪粪。接种物污泥取自沈阳农业大学“中国东北寒冷地区综合能源示范基地”猪粪正常沼气发酵后的活性污泥, 其总固体含量w(TS)为8%, 经测定不含抗生素。SMZ购自购自德国Dr. Ehrenstorfer公司(纯度w为97%)。试验材料基本性质见表 1。
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表 1 试验材料基本性质 Table 1 Basic parameters of experiment materials |
试验装置为自制排水集气法简易发酵装置, 主要由2.5 L发酵瓶、2 L集气瓶和2 L排水瓶3部分组成。发酵瓶置于37 ℃恒温水浴锅内, 发酵瓶与集气瓶瓶口用胶塞塞紧, 各部分用乳胶管连接, 所有接口处均用石蜡和凡士林密封。
1.3 试验设计试验设计取预处理完成的玉米秸秆和猪粪, 试验猪粪与秸秆质量比例为2:1, 取新鲜猪粪400 g, 碎秸秆200 g加入到发酵瓶中, 根据2种原料含水率以及C/N比, 加水调节总固体w为8%, C/N比为25:1, 接种沼液30%(以湿重计)。共设置4个处理, SMZ添加量(占干猪粪的比例)依次为:0(CK)、20(T1)、60(T2) 和120 mg·kg-1(T3), 将SMZ溶液与原料充分混匀装入发酵罐内, 密封在暗处进行发酵, 每个处理重复3次。
1.4 样品采集分别在沼气发酵的3、6、9、12、15、18、21、24、27、35、45、50 d对沼气发酵沼渣沼液混合物进行采样(采样前晃动发酵罐混匀), 4 ℃冰箱冷藏, 用于酶活性的测定。
1.5 样品测定 1.5.1 酶活性的测定水解酶活性测定方法参照关松荫[14]的方法。脲酶活性采用比色法测定，以24 h后1 g样品中生成NH3-N的质量表示，mg·g-1·d-1；脱氢酶活性以1 h后1 g样品中生成2, 3, 5-三苯基甲腙(TF)的质量表示，μg·g-1·h-1。
1.5.2 沼气发酵不同时期微生物群落功能多样性测定Biolog测定方法参见文献[15]。具体操作步骤如下:分别从第6天(启动期)、第18天(产气稳定期)、第35天(产气下降期)的各个沼气发酵瓶中取沼液, 用w=0.85%无菌生理盐水稀释500倍。在超净工作台上, 分别吸取150 μL菌悬液接种于ECO微平板中的每一个小孔, 将接好种的Biolog-ECO板置于28 ℃恒温培养箱中培养, 连续培养240 h, 并每隔24 h在Biolog读数仪上读取590 nm波长处吸光值。
1.6 相关指标的计算平均颜色变化率(average well colour development, DAWC)的计算公式[16-18]为
| $ {D_{{\rm{AWC}}}} = \sum {({C_i} - R)/n}。$ | (1) |
式(1) 中, Ci为第i个非对照孔的吸光值; R为对照孔(A1) 的吸光值; Ci-R计算中记为0;n为培养基碳源种类数, 该研究中为31。
采用培养96 h后的数据来表征BIOLOG板中的微生物碳源代谢功能多样性特征, 微生物群落Shannon多样性指数(H′)计算公式为
| $ H\prime = - \sum {{P_i} \times \ln {P_i}} 。$ | (2) |
式(2) 中, Pi为第i个非对照孔的吸光值与所有非对照孔吸光值总和的比值。
Simpson指数(D)又称优势度指数, 是对多样性方面即集中性的度量。
| $ D = 1 - \sum {{P_i}^2} 。$ |
数据采用Microsoft Excel 2003软件进行统计分析和制图。
2 结果与分析 2.1 SMZ对脲酶活性的影响脲酶是氮循环的一种关键性酶, 能促进含氮有机物的水解, 分析脲酶活性变化对于了解沼气发酵过程中蛋白质等含氮有机物的分解具有重要意义[19]。由图 1可知, 各处理脲酶活性基本呈先升高后降低的趋势, 在沼气发酵初期(3~6 d), T1和T2处理脲酶活性显著高于CK处理(P＜0.05), T3处理脲酶活性与CK处理差异不显著(P＞0.05), 表明在沼气发酵初期添加中低浓度SMZ促进了脲酶活性。
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图 1 沼气发酵过程中脲酶活性的变化 Figure 1 Variations of urease during biogas fermentation process CK、T1、T2和T3分别指ρ(磺胺二甲嘧啶)为0、20、60和120 mg·kg-1。 |
各处理脲酶活性均在第9天达最大值, 在第9~15天添加SMZ各处理脲酶活性显著低于CK处理(P＜0.05), 可能是SMZ发挥了累积毒性作用, 减弱了脲酶活性; 在沼气发酵18 d后, 各处理之间脲酶活性差异均不显著(P＞0.05), 可能是随着SMZ在沼气发酵过程中的不断降解, 其对微生物抑制作用减弱, 各处理脲酶活性逐渐恢复到CK水平。
2.2 SMZ对脱氢酶活性的影响脱氢酶在厌氧发酵的能量循环和物质循环中扮演重要角色, 脱氢酶活性能直接用于表示生物细胞对其基质降解能力的强弱, 是微生物降解有机污染物、获得能量的必需酶[20-21]。由图 2可知, CK、T1、T2和T3各处理厌氧发酵液中脱氢酶活性均呈先升高后降低趋势。
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图 2 厌氧发酵过程中脱氢酶活性的变化 Figure 2 Variations of dehydrogenase during biogas fermentation process CK、T1、T2和T3分别指ρ(磺胺二甲嘧啶)为0、20、60和120 mg·kg-1。 |
在沼气发酵的第3~12天, T2和T3处理脱氢酶活性显著低于T1和CK处理(P＜0.05), T3处理脱氢酶活性最低, 表明在沼气发酵前期中高浓度的SMZ显著抑制脱氢酶活性; 在沼气发酵的第15~21天, 各处理之间脱氢酶活性差异不显著(P＞0.05);24 d以后, T3处理脱氢酶活性显著高于其他处理(P＜0.05), 而CK、T1和T2各处理之间差异不显著。
2.3 沼液微生物群落代谢平均颜色变化率(DAWC)DAWC是反映微生物代谢活性的重要指标, 体现了不同微生物对相同碳源利用的差异性, DAWC越大，则碳源利用程度越高, 表示微生物活性也越高[22]。由图 3可看出, 随着培养时间的延长，DAWC不断增大, 在24 h前各处理DAWC很小, 说明在24 h之内碳源基本未被利用, 24 h之后DAWC迅速升高进入对数增长期直至144 h。
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图 3 沼气发酵不同时期微生物群落代谢平均颜色变化率(DAWC)变化 Figure 3 DAWC variation during different periods of biogas fermentation CK、T1、T2和T3分别指ρ(磺胺二甲嘧啶)为0、20、60和120 mg·kg-1。 |
由图 3可见, 在沼气发酵启动期(第6天), T2和T3处理DAWC在培养72 h后显著低于CK处理(P＜0.05), 随着SMZ浓度的增高，其相应的DAWC不断降低, 表明在沼气发酵启动期中高浓度SMZ抑制了DAWC。在沼气发酵的产气下降期(第35天), T2和T3处理DAWC在培养72 h以后显著高于CK处理(P＜0.05), 表明在沼气发酵中后期中高浓度SMZ提高了DAWC。在沼气发酵产气稳定期(第18天), 各处理之间DAWC差异不显著(P＞0.05)。同时, 在沼气发酵的不同阶段DAWC变化趋势不同, 从大到小依次为启动期、产气稳定期和产气下降期, 说明沼气发酵不同阶段微生物对碳源的利用能力也不同。
2.4 沼气发酵过程中微生物群落多样性指数变化沼气发酵过程中微生物群落功能多样性是衡量沼液微生物群落状态与功能的指标, 反映沼液中微生物的生态特征。Shannon多样性指数(H′)表示群落的丰富度, 一般来说, 物种数多且较均匀的群落, Shannon指数较高, 当物种数量或均匀度下降时, Shannon指数也下降[22]。Biolog微平板中能被利用的碳源, 即物种数越多且利用强度越大, 则Shannon指数也越大。Simpson指数较多地反映了群落中最常见的物种, 表示某个物种的优势度, 数值越大表明得到同一物种的概率越大, 因而微生物多样性越低[23]。选取培养96 h时的数据对沼液中微生物群落功能多样性进行分析(表 2)。
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表 2 沼气发酵不同阶段微生物多样性指数 Table 2 Diversity and evenness indices for microbial communities of Biogas slurry microbial |
在沼气发酵启动期(第6天), CK处理Shannon指数和Simpson指数最高, 与T1、T2和T3处理之间差异显著(P＜0.05), 表明在沼气发酵的初始阶段, SMZ能够显著降低微生物群落的功能多样性和物种丰富度; 在沼气发酵的产气稳定期(第18天)各处理之间Shannon指数和Simpson指数差异不显著(P＞0.05), 而在沼气发酵产气下降期(第35天), T2和T3处理Shannon和Simpson指数显著大于CK处理(P＜0.05), 且随着SMZ浓度的增加而增加。
3 讨论沼气发酵过程同时也是酶促反应的过程, 沼气发酵原料的发酵产气都是在微生物作用下逐步进行酶促反应的结果[24]。近年来研究发现, 畜禽粪便中残留的抗生素会影响沼气发酵过程中水解酶活性和微生物多样性[20], 进而影响沼气发酵效能。水解类酶活性决定着整个发酵过程的速度, 脲酶是沼气发酵过程中一种重要的水解酶。在沼气发酵初期, 中低浓度SMZ对脲酶活性有激活作用, 随着发酵时间的延长, SMZ对脲酶活性有抑制作用。该结果与已有文献研究结论类似, 如陈智学等[25]研究发现, 在堆肥前期, 土霉素刺激脲酶活性, 随着堆肥时间的延长, 土霉素对脲酶活性的影响由刺激变为抑制作用; 国彬等[9]研究磺胺类兽药对土壤脲酶活性的影响发现培养前期低浓度时为激活, 高浓度时为抑制作用, 培养后期低、高浓度时均为抑制作用; 张凯煜等[26]发现在堆肥前期SMZ对脲酶活性无显著影响, 而在堆肥腐熟期SMZ对脲酶活性有抑制作用, 且抑制作用随抗生素含量的增加而增加。
脱氢酶是一种氧化还原类酶, 其活性可以反映厌氧发酵过程中有机质分解速率和微生物活动强度。笔者研究发现低浓度SMZ对沼气发酵过程中脱氢酶活性没有影响, 中浓度SMZ在沼气发酵前期表现为抑制作用, 后期影响不大, 高浓度SMZ对脱氢酶活性表现为先抑制后促进作用。张凯煜等[26]发现, 添加高浓度SMZ对堆肥中脱氢酶活性表现为先抑制后促进作用, 杨玖等[21]研究也发现, 磺胺甲唑在低浓度时会抑制脱氢酶活性, 高浓度时会促进脱氢酶活性。GUTIÉRREZ等[27]研究发现, 较低浓度磺胺类抗生素对脱氢酶活性具有显著抑制作用, 其抑制作用随着浓度的增大而减小, 笔者研究结果与之基本一致。但是, 潘洪加等[20]研究认为, 厌氧发酵前期, 不同浓度土霉素对脱氢酶活性均表现为抑制作用, 厌氧发酵后期, 只有高浓度土霉素处理脱氢酶活性显著小于对照。金彩霞等[28]研究发现磺胺间甲氧嘧啶对土壤过氧化氢酶活性的影响表现为“激活—恢复—激活”的规律。不同学者研究结果之间的差异可能与抗生素的种类与浓度、试验设计、研究方法等有关。
沼气发酵系统是一个由多种微生物菌群组成的复杂生态系统。研究沼气发酵系统微生物群落结构特征可以揭示影响沼气发酵效能的生物因素。INCE等[29]研究了土霉素对牛粪沼气发酵过程中微生物种群的影响, 结果显示, 当牛粪中土霉素质量含量为20 mg·kg-1时, 活细菌和主要产甲烷菌(methanomicrobiales)的种群数量与土霉素浓度存在负相关关系, 表明土霉素抑制沼气发酵微生物种群数量; AYDIN等[30]研究发现, 高浓度磺胺甲唑、红霉素和四环素会对厌氧发酵系统微生物群落结构产生抑制作用。SHIMADA等[31]利用定量荧光原位杂交法分析了不同浓度泰乐菌素对厌氧反应器中产甲烷微生物群落的影响, 与对照相比, 添加高质量浓度(167 mg·L-1)泰乐菌素显著降低了产甲烷微生物群落多样性。
Biolog微平板技术因无需分离纯种微生物、操作简便、灵敏度高等优点, 广泛应用于各种环境微生物群落的研究中。DAWC及沼气发酵微生物代谢功能多样性指数在一定程度上可以反映沼气发酵微生物的活性及多样性[32-33]。在沼气发酵启动期, 添加中质量含量(60 mg·kg-1)和高质量含量(120 mg·kg-1)SMZ对DAWC具有抑制作用, 说明这期间SMZ对沼气发酵系统中微生物活性起抑制作用; 而沼气发酵的产气下降期, 中高浓度SMZ对DAWC有促进作用, 可能是因为随着沼液中SMZ的不断降解, 被SMZ抑制的微生物数量及活性有所恢复, 提高了微生物整体活性, 笔者研究结果与张凯煜等[26]的研究结果相似。在沼气发酵不同时期SMZ对微生物群落功能多样性影响不同, 在沼气发酵的启动期, SMZ对沼液中微生物群落的功能多样性和物种丰富度具有显著抑制作用; 随着沼气发酵时间的延长, 在沼气发酵产气下降期(第35天), 添加中质量含量(60 mg·kg-1)和高质量含量(120 mg·kg-1)SMZ处理增加了微生物群落的功能多样性和物种丰富度, 这与陈智学等[25]的研究结果一致。原因可能在于在沼气发酵初期, SMZ对微生物的生长有抑制作用, 从而导致微生物群落多样性降低; 随着发酵时间的延长, SMZ诱导产生了具有显著优势度的抗药性菌群, 微生物群落的功能多样性增高。Biolog法最初仅被用于菌种鉴定, 1991年GARLAND等[34]首次将Biolog方法应用于分析微生物群落特征, 近年来Biolog法被广泛应用于各种环境微生物群落的研究中。但是, Biolog微平板法仅能检测可培养的微生物, 不能全面反映微生物的群落组成结构信息[33], 如果要深入研究沼气发酵系统中微生物群落结构、功能及其相互关系, 还需结合荧光原位杂交技术(FISH)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、高通量测序等[35]一些分子生物学方法来进一步深入分析微生物群落功能多样性。
4 结论SMZ对猪粪沼气发酵过程中水解酶活性和微生物群落功能多样性的影响较大, 在沼气发酵不同时期, SMZ对水解酶活性和微生物群落功能多样性的影响也不同。添加中低浓度SMZ处理对沼气发酵过程中脲酶活性呈现先激活后抑制作用, 而添加高浓度SMZ处理对脱氢酶活性表现为先抑制后促进作用。添加中高浓度SMZ对沼气发酵过程中平均颜色变化率(AWCD)和微生物群落的功能多样性具有先抑制后促进作用。
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