2. 中国科学院地球化学研究所环境地球化学国家重点实验室, 贵州 贵阳 550081;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
2. State Key Laboratory of Environmental Geochemistry, Institute of Geochemistry, Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550081, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
贵州省是岩溶发育强烈的典型生态脆弱区[1-2], 也是酸沉降严重的地区, 有关大气酸性降水的研究早在20世纪80年代就有报道[3]。贵州大气酸沉降主要是硫酸型[4-5]。近年来对位于贵州省普定县境内的典型喀斯特小流域的监测显示, 大气降水的雨量加权pH值低于5.0, 以SO42-计算的硫湿沉降通量达50~60 kg·hm-2·a-1, 等于或高于20世纪90年代西欧和北美部分地区大气酸沉降达峰值时估算的硫沉降通量[5-6]。长时期的大气硫沉降致使土壤溶液中积存过量的SO42-, 这会刺激土壤生物和植被对SO42-的同化吸收, 进而增大土壤有机硫含量[7-8], 同时土壤溶液中SO42-含量增大导致SO42-淋溶程度增强, 这又会导致土壤中碱性阳离子库的流失[9-10]。另一方面, 酸沉降持续输入SO42-进入土壤溶液, 也可能刺激厌氧细菌驱动的SO42-异化还原过程[7], 这一过程消耗土壤溶液中的SO42-(被还原形成还原态的无机硫化物), 使其成为酸沉降输入土壤SO42-的一个不可忽视的汇。
硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria, SRB)是一大类厌氧菌, 包含很多不同的类群, 广泛分布于地表厌氧和缺氧的水陆生境[11]。SRB在其代谢活动中可以在有机碳源供给的厌氧微生境中还原SO42-, 形成各种还原态的无机硫化物(total reduced inorganic sulfur, TRIS)[12-13]。地表环境中(≤50 ℃)SRB驱动的SO42-异化还原过程导致大规模的SO42-被还原以及有机质被厌氧矿化[14-15], 是联系碳硫耦合循环过程的重要纽带[16]。研究表明, SO42-含量、有机碳源类型和数量以及小生境微生物群落组成是影响SRB分布的主要环境因素[17]。石灰土是西南喀斯特山区碳酸盐岩基岩风化形成的主要土壤类型。从检索到的文献来看, 目前对受酸沉降影响的石灰土中SRB驱动的硫的微生物地球化学循环过程及其环境效应的关注较少。笔者以贵州省安顺市普定县境内陈旗和后寨河典型喀斯特小流域石灰土为代表, 通过分析石灰土硫形态和SRB类群及数量分布特征, 结合石灰土基本理化参数分析, 阐明酸沉降下石灰土中不同形态硫的迁移转化过程, 深化对喀斯特地区土壤硫的微生物地球化学循环过程的认识, 以期为西南喀斯特流域土壤石漠化生态环境修复提供基础科学参考。
1 材料与试验 1.1 研究区与样品采集研究区位于贵州省安顺市普定县境内陈旗(26°15′33.90″ N, 105°46′38.41″ E, 海拔1 324 m)和后寨河(26°16′59.56″ N, 105°40′47.36″ E, 海拔1 159 m)小流域。普定县多年平均气温为15.1 ℃，平均降水量为1 378 mm。2个小流域内自然坡地坡度多大于25°, 坡地土壤以黄色石灰土为主, 土壤黏着性差且浅薄, 坡地土壤深度一般小于60 cm。选择小流域内未受人类活动影响的自然坡地, 于2013年6月采集土壤样品, 采样时分别在上坡、中坡和下坡选取微地形和植被类型相对比较均一的位置挖取石灰土剖面样品, 从剖面表层向下以10 cm间隔分层取样, 在每个土层中部即5、15、25、35和45 cm深度处取样，每个剖面采集5个样品。所有样品经自然风干后分别研磨过2和0.15 mm孔径筛, 供后续试验分析。采样具体情况见表 1。
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表 1 普定县石灰土剖面采样情况 Table 1 Field description of limestone soil profiles and sampling in Puding County |
土壤样品经0.5 mol·L-1盐酸处理去除无机碳酸盐后，用元素分析仪(Elementar Vario Macro, 中国科学院地球化学研究所环境地球化学国家重点实验室)测定有机碳含量[18], 测试精度≤0.1%。石灰土黏粒(粒径＜2 μm)含量比例利用筛分结合静水沉降的方法进行分析测定[19]。土壤pH值测定采用无CO2去离子水作浸提剂, 浸提剂与石灰土样品的质量比为2.5:1。石灰土样品在105 ℃烘箱中烘至恒定质量, 根据样品损失的质量测定含水量[8]。
1.3 石灰土各形态硫含量的测定总硫用艾氏卡熔融法提取, 根据生成的BaSO4沉淀重量测定总硫含量[7]。土壤SO42-用KH2PO4溶液提取[20], 提取液经0.45 μm孔径醋酸纤维滤膜过滤后用离子色谱仪(DIONEX ICS-90, 中国科学院地球化学研究所环境地球化学国家重点实验室)测定SO42-含量, 测试精度≤1%。总还原态硫(total reducing inorganic sulfur, TRIS)用HCl-CrCl2混合溶液浸提[21], 随后用重量法分析TRIS含量[22-23]。有机硫含量通过总硫含量减去硫酸盐态硫(SO42--S)和TRIS含量得到。
1.4 聚合酶链式反应(PCR)分析石灰土中SRB类群 1.4.1 DNA提取与纯化根据土壤DNA提取和纯化试剂盒(Ultra CleanTM Soil DNA Isolation Kit)的操作说明, 对石灰土样品DNA进行提取和后续的纯化操作。依据张伟等[24]的方法进行DNA含量和纯度分析。最后将检测合格的土壤DNA稀释至50 ng·μL-1供后续分析。
1.4.2 PCR扩增分析SRB类群根据DALY等[11]的研究, 地表水陆生境中常见的SRB可分为6大类群，分别为脱硫肠菌属(Desulfotomaculum, DFM)、脱硫叶菌属(Desulfobulbus, DBB)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium, DBM)、脱硫细菌属(Desulfobacter, DSB)、脱硫球菌属-脱硫线菌属-脱硫八叠菌属(Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina, DCC-DNM-DSS)和脱硫弧菌属-脱硫微菌属(Desulfovibrio-Desulfomicrobium, DSV-DMB)。SRB的6大类群的PCR扩增步骤依据WANG等[25]的方法进行。
1.4.3 参考菌株该研究中SRB的6大类群PCR扩增的阳性控制菌株和阴性控制菌株参照张伟等[24]的研究。
1.5 荧光原位杂交反应(FISH)分析石灰土中SRB数量 1.5.1 寡核苷酸探针该研究中检测SRB的探针为SRB385[26], 阴性对照探针为NON338[27]。
1.5.2 土壤样品预处理与FISH镜检计数按照张伟等[24]的操作方法进行土壤样品预处理和FISH镜检计数。
1.5.3 参考菌株SRB FISH试验操作的阳性控制菌株和阴性控制菌株参照张伟等[24]的研究。
2 结果与讨论 2.1 石灰土pH值、C/S比、有机碳和黏粒含量、含水量图 1给出了石灰土pH值、C/S比、有机碳和黏粒含量、含水量的深度分布特征。不同深度石灰土pH值为7.0~7.3, 后寨河剖面pH值略高于陈旗剖面, 沿剖面深度增加pH值变化不大。石灰土剖面不同深度w(有机碳)为2.6%~7.1%, 陈旗和后寨河2个小流域石灰土剖面相同深度有机碳含量变化不大, 并且均随剖面深度增加而急剧减小。石灰土剖面不同深度C/S比为83.7~123.7, 2个小流域石灰土剖面相同深度C/S比变化不大, 并且均随剖面深度增加而降低。不同深度石灰土w(黏粒)为29.2%~33.4%, 2个小流域剖面相同深度黏粒含量变化不大, 并且均随剖面深度增加变化不大。石灰土剖面不同深度含水量w为28.7%~38.3%, 2个小流域石灰土剖面相同深度含水量变化不大, 从深度分布来看, 剖面表层至次表层含水量增大, 次表层以下随深度增加含水量有降低趋势。
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图 1 石灰土剖面pH值、C/S比、有机碳和黏粒含量、含水量的深度分布特征 Figure 1 Variation of soil pH, organic carbon content, C/S ratios, clay content, and soil water content in the limestone soil profiles with depth |
陈旗和后寨河小流域石灰土剖面总硫、SO42--S、TRIS和有机硫含量的深度分布特征见图 2。
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图 2 石灰土剖面硫含量的深度分布特征 Figure 2 Distributions of sulfur contents along the limestone soil profiles CL－1、CL－2和CL－3为陈旗小流域土样；HL－1和HL－2为后寨河小流域土样。 |
经对比发现, 长期大气酸沉降致使西南喀斯特流域石灰土总硫和SO42--S含量显著高于未受大气酸沉降影响流域土壤总硫和SO42--S含量[4, 28]。有机硫是石灰土剖面不同深度硫的主要形态, 有机硫占总硫含量的比例为83.3%~93.1%, 这个结果与其他流域土壤硫含量的研究结果相似[29-30]。石灰土剖面表层有机硫占总硫比例较高, 随剖面加深总硫和有机硫含量逐渐降低, 这主要是有机硫矿化的结果[31-32]。SO42-是石灰土主要的无机硫形态。SO42--S和TRIS含量占总硫含量的比例较小, 分别为4.2%~7.3%和1.9%~8.2%。SO42--S含量在剖面表层最高, 随剖面加深, SO42--S含量逐渐降低, 而TRIS含量有增大的趋势, 这可能与SO42-异化还原和淋溶迁移有关[33-34]。
2.3 SRB类群和数量在石灰土中的分布SRB类群在石灰土剖面中的分布见表 2。SRB的6大类群的PCR扩增结果显示, 石灰土剖面中检出脱硫叶菌属和脱硫弧菌属-脱硫微菌属。脱硫弧菌属-脱硫微菌属在陈旗和后寨河小流域石灰土剖面的不同深度均有检出, 说明脱硫弧菌属-脱硫微菌属是石灰土中SRB的优势类群。有研究表明, 在水稻土和不同类型湖泊(湿地)沉积环境中, 脱硫弧菌属-脱硫微菌属也是SRB的优势类群[35-37]。这些研究结果指示, 在不同生境条件下脱硫弧菌属-脱硫微菌属相比其他SRB类群具有更强的适应能力, 这可能与脱硫弧菌属-脱硫微菌属具有更复杂多样的系统进化有关[38-39]。
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表 2 SRB类群在石灰土剖面中的分布 Table 2 Distributions of SRB groups along the limestone soil profiles |
FISH是一种无需室内纯培养即可检测具有特定生态环境功能细菌的微生物学技术, 由于SRB在地表环境硫循环过程中的重要性, FISH广泛应用于地表各类型生境中的SRB数量分析[39-40]。该研究中FISH结果显示, 石灰土剖面中SRB数量(以湿土计)为0.87×104~ 4.57×104 g-1(图 3)。SRB数量的深度分布在2个小流域石灰土剖面中具有相似性, 表现为SRB数量最大值均出现在剖面次底层(HL-1剖面除外), 指示石灰土剖面次底层最适于SRB发育。结合图 1~2可以看出, SO42--S含量和有机碳含量在剖面次底层均较高, 并且相比剖面表层和中层, 剖面次底层具有更好的厌氧环境, 这些环境因素可能导致SRB数量在剖面次底层达最大值[41]。
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图 3 石灰土剖面硫酸盐还原菌(SRB)数量的深度分布特征 Figure 3 Distributions of SRB population in the limestone soil profiles with depth CL-1、CL-2和CL-3为陈旗小流域土样; HL-1和HL-2为后寨河小流域土样。SRB数量以湿土计。 |
在没有采矿活动的土壤生境, SRB驱动的SO42-异化还原反应是土壤中TRIS的主要来源[21, 33]。石灰土剖面SRB数量、SO42--S含量和TRIS含量的深度分布如图 4所示。石灰土剖面中TRIS含量与SRB数量呈现基本一致的分布特征(在次底层达最大值), 并且总体上TRIS含量与SRB数量增大的土层深度对应SO42--S含量降低的土层深度。这些分布特征指示, 随剖面加深SRB驱动的SO42-异化还原反应过程中, TRIS是反应的主要产物。
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图 4 石灰土剖面SRB数量、SO42--S含量和TRIS含量的深度分布特征 Figure 4 Distributions of SRB population, SO42--S content and TRIS content in the limestone soil profiles with depth CL-1、CL-2和CL-3为陈旗小流域土样; HL-1和HL-2为后寨河小流域土样。SRB数量以湿土计。 |
如前所述, 驱动SO42-异化还原反应的SRB是厌氧细菌。石灰土剖面中存在厌氧微生境并发生SO42-异化还原反应可能与以下因素有关。第一, 该研究于2013年6月末采集石灰土样品, 6月正值当地雨季, 多阴雨天气, 空气潮湿。石灰土剖面表层样品采样深度为表土向下5 cm, 土壤含水量相对较高(图 1)。石灰土剖面表层以下深度在多雨潮湿的天气条件下可能存在厌氧的生境条件, 致使剖面中存在厌氧的SRB驱动的SO42-异化还原反应。第二, 有研究表明, 某些SRB类群(如脱硫微菌属)不是严格的厌氧菌[42-43], 这可能导致石灰土中不是厌氧状况的微生境发生SO42-异化还原过程。最后, 某些SRB类群可用不同方式在其生存环境周围形成缺氧乃至厌氧的微生境, 例如利用金属硫化物形成局部厌氧的聚合物颗粒[44], 这些聚合物颗粒通常形成于有机质氧化分解产生的络合物附近, 由于有机质氧化分解导致土壤溶液中的溶解氧被快速消耗而形成局部厌氧的微生境[35]。在喀斯特地区潮湿的石灰土中, 腐烂的枯枝落叶和植被根系的分解残体可以提供快速氧化分解的有机质，形成局部厌氧的微生境, 在这个微生境内可能发生SO42-异化还原反应。
土壤TRIS也可能来自基岩风化, 但SRB数量和TRIS含量增大的土层深度与SO42--S含量降低的土层深度基本一致, 结合对石灰土存在厌氧微生境的分析, 说明石灰土剖面中发生SRB驱动的SO42-异化还原反应, 并且反应的主要产物是TRIS。石灰土剖面中SRB数量与TRIS含量均在次底层达最大值, 而次底层SO42--S含量较中层和表层明显降低, 指示石灰土剖面次底层SRB驱动SO42-异化还原反应的活性最大, 在这个深度大量SO42-被异化还原形成TRIS。
有机碳含量在石灰土剖面中随剖面加深而急剧降低(图 1), 这可能限制了剖面底层SO42-异化还原反应所需的有机碳源的供给, 进而导致底层反应速率和TRIS含量降低[41]。
2.5 有机硫矿化有机硫形态是石灰土剖面中硫的主要形态。石灰土剖面表层至底层总硫和有机硫含量逐渐降低(图 2), 这与欧洲一些地区土壤剖面中总硫和有机硫的深度分布相似, 主要与有机硫在剖面中的矿化有关[31-32]。有机硫矿化是土壤硫循环的重要过程[31-32]。NORMAN等[45]开展的室内土壤淋滤试验显示, 土壤中有机硫化物矿化分解涉及2步反应。第1步是慢速反应, 即碳键形态硫转化形成有机硫酸盐; 第2步是快速反应, 即有机硫酸盐水解转化形成次生SO42-。有机硫酸盐和次生SO42-均可通过淋溶而向下迁移。根据以上分析, 石灰土剖面有机硫含量随剖面加深而逐渐降低, 指示了石灰土剖面中持续进行的有机硫矿化过程, 以及矿化产物有机硫酸盐水解和次生SO42-的淋溶迁移过程。因为有机硫是石灰土硫的主要存在形态, 致使总硫含量随剖面加深而逐渐降低(图 2)。
2.6 SO42-的生物滞留与迁移地表土壤和植物同化吸收硫元素的主要形态是SO42-, SO42-被生物同化吸收后形成有机硫化物。除了形成有机硫化物, 酸沉降输入石灰土剖面中的SO42-可在SRB作用下经异化还原反应形成TRIS[21, 33]。生物滞留(SO42-同化还原形成有机硫化物和异化还原形成TRIS)后SO42-的吸附、解吸和淋溶迁移过程是影响剖面中SO42--S垂直分布的主要因素。土壤pH值是影响SO42-吸附和解吸过程的重要因素[29, 46]。石灰土剖面pH值变化范围为7.0~7.3, 同时石灰土黏粒含量比黄壤低[5], 因此石灰土对SO42-的吸附基本可以忽略[46]。石灰土中SO42-经生物滞留后剩余的部分通过淋溶迁移进入地下水, 或者短暂滞留在剖面中的SO42-被解吸下来的先前吸附的SO42-所替代, 导致SO42-在石灰土剖面中形成一个稳定的向下迁移的通量。因此, SO42-的生物滞留和淋溶迁移导致石灰土剖面中SO42--S含量随剖面加深而逐渐降低(图 2、4)。有机硫酸盐快速水解产生的次生SO42-也伴随解吸的SO42-向下迁移。SO42-在石灰土剖面中的淋溶迁移会导致等当量的碱性阳离子迁移出土壤剖面[9-10], 但目前来看, 由于石灰土钙镁含量丰富, SO42-的迁移并没有导致石灰土pH值明显降低[34], 石灰土没有酸化。
3 结论石灰土剖面主要的硫形态是有机硫。总硫和有机硫含量在石灰土剖面表层至底层降低与有机硫持续矿化有关。石灰土剖面中检出脱硫叶菌属和脱硫弧菌属-脱硫微菌属类群。剖面中SRB数量与TRIS含量增大的土层深度与SO42--S含量降低的土层深度基本一致, 指示剖面中发生了以TRIS为主要产物的SO42-异化还原反应。石灰土较高的pH值和较低的黏粒含量不利于SO42-吸附, SO42-经生物滞留(同化还原形成有机硫和异化还原形成TRIS)后剩余的部分主要通过淋溶而迁移出石灰土剖面。目前来看, 由于石灰土钙镁含量丰富, 酸沉降下伴随SO42-淋溶迁移的碱性阳离子的淋失并没有引起土壤pH值的显著降低。但值得关注的是, 酸沉降输入的SO42-主要以有机硫形态滞留在石灰土中, SO42-吸附不是主要的硫滞留方式, 则在硫的年沉降通量显著降低后, 石灰土中有机硫矿化在较长时期内可能导致大量SO42-进入流域水体, 与之相关的流域土壤理化性质和水体化学组成变化等相关的环境效应应予以关注。
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