1886年洛桑Park Grass试验表明, 长期不合理施用化学肥料引起了土壤酸化、生产力降低、重金属元素活化等问题[1]。同时, 频繁施用氮肥能够直接影响土壤中NO3--N水平, 从而导致地下水污染[2]。另外, 化学肥料的不合理施用对土壤微生物数量和多样性的影响也非常显著。ORR等[3]研究表明, 随着水稻种植年限的增加和化学氮肥的施用, 细菌/真菌(B/F)比值下降, 增加了水稻病害发生的概率。同时, nifH基因丰度也明显降低, 稻田生态系统中生物固氮作用对水稻氮含量的贡献越来越小。
在我国有机农业生产过程中存在着严重的连续大量施用有机肥的问题, 尤其在常规农业到有机农业的转换阶段[4]。太湖流域有机稻麦轮作系统中有机肥的年施用量达60 t·hm-2以上。但是, 我国商品有机肥原料大部分来源于集约化养殖场的畜禽粪便, 而畜禽粪便中重金属含量较高; 有机肥的施用通常基于作物对氮的需求来计算, 而其氮/磷比值一般小于作物对氮和磷的需求比例; 高温堆肥过程也可以定义为硝化过程, 随着堆肥的进行, 在硝化细菌的作用下, NH4+-N含量逐渐降低, 而NO3--N含量逐渐增加, 有机肥尤其是畜禽粪便有机肥中含有较高的NO3--N。因此, 有机肥连续过量施用同样存在环境风险。
通过调研方式, 确定了稻麦轮作系统的化肥施用量, 在此基础上, 根据N投入量和有机肥N含量换算出有机肥施用量, 研究了等氮条件下有机肥与化学肥料的连续大量施用可能引起的环境风险。该研究的开展将为通过有机农业方式控制农业面源污染提供技术支撑。
1 材料方法 1.1 研究地点试验点设于常州市武进区雪堰镇万寿村, 地邻太湖湖区。地块中心坐标为31°29′24″ N, 120°05′05″ E。地块海拔为12.6 m, 地形地貌类型为丘陵谷地, 土地平整。选取一长期进行稻麦轮作的试验地块, 耕作层15 cm, 犁底层为15~25 cm, 土壤基本理化性质如下:pH值为5.93, w(有机碳)为13.25 g·kg-1, w(全氮)为1.06 g·kg-1, w(全磷)为0.37 g·kg-1, w(全钾)为137.12 g·kg-1。
1.2 试验处理设置试验共设3个处理:对照(CK)、化肥处理(CF)和等氮条件下有机肥处理(CP), 每个处理3个重复, 共9个小区。化肥与有机肥的营养和重金属含量见表 1。小区规格为5 m×6 m, 各小区随机分布, 每个小区用30 cm×30 cm的田埂隔开, 并用塑料薄膜包裹, 防止渗漏。每个处理的施肥量见表 2。按照各处理的施肥量将化肥或者有机肥均匀撒施于土壤表面, 有机肥均为以畜禽粪便为原料的商品有机肥。每个小区播种等量水稻或小麦种子, 田间管理方式完全一致。冬小麦种植时间约在每年12月, 小麦收获后进行水稻种植(约6月)。试验从2012年开始共种植3季水稻和3季小麦。
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表 1 有机肥和化肥的养分及重金属含量 Table 1 Contents of nutrients and heavy metals in organic and chemical fertilizer |
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表 2 有机肥和化肥施用量 Table 2 Amount of organic and chemical fertilizer applied |
第3季水稻收获后采集土壤样品。每个小区使用直径为5 cm的土钻在5个不同位置采集0~25 cm耕作层土壤, 彻底混匀后采用四分法分成3份, 一份保存于-80 ℃条件下, 一份保存于4 ℃条件下, 一份自然风干。
pH值采用pH计测定, 全氮含量采用半微量凯氏法测定; 全磷含量采用氢氟酸-高氯酸消化, 钼蓝比色法测定; 速效磷含量用0.5 mol·L-1 NaHCO3法浸提、钼锑抗比色法测定; 铵态氮和硝态氮用2 mol·L-1 KCl溶液浸提, 采用流动分析仪检测; 微生物量碳、氮含量采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法(FE)测定。微生物量碳、氮的换算系数均为0.45。
土样细菌群落总DNA的提取采用美国MOBIO公司的Power Max Soil DNA Isolation Kit, 采用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′), 针对样品细菌16S rDNA的V4/V5区进行PCR扩增。委托上海美吉诺生物科技有限公司采用Illumina Miseq测序平台上机测序。扩增体系、反应条件以及数据处理方法参见文献[5]。
1.4 数据处理数据经Excel 2010整理后, 采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析, 不同处理之间采用Duncan新复极差法进行多重比较。
2 结果与讨论 2.1 土壤全氮和硝态氮图 1显示，化学肥料和有机肥连续大量施用均显著增加土壤全氮和硝态氮含量(P < 0.05)。CF处理土壤中w(全氮)为1.53 g·kg-1, CP处理为1.84 g·kg-1, 均显著高于CK处理(P < 0.05)。在作物吸收全氮和铵态氮差异不显著的情况下, CF处理更多的氮通过地表径流、淋溶或温室气体等方式排到环境中, 造成更大的环境风险。
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图 1 连续大量施肥对土壤全氮、硝态氮和铵态氮含量的影响 Figure 1 Effects of continuous fertilization on total nitrogen and nitrate in soil CK为对照, CF为化肥处理, CP为等氮条件下有机肥处理。 直方柱上方英文小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P < 0.05)。 |
CF处理硝态氮含量显著高于CP处理(P < 0.05), 大量施用化肥会发生强烈的硝化作用, 造成硝态氮的大量积累[6]。同时, 硝化作用伴随着质子的产生, 这也是CF处理土壤pH值明显低于CP处理的原因。硝态氮以硝酸根离子态存在, 与土壤颗粒均带负电荷, 不能被土壤胶体所吸附, 如果在一定时期内不能被植物吸收利用就很容易随土壤水分转移, 发生地表径流和淋溶。另外, 研究证明当土壤中硝态氮含量增加时会刺激农作物特别是叶菜类作物的吸收和积累[7]。显然, 相对于CF处理, CP处理在土壤硝酸盐积累方面引起的面源污染和农作物品质方面的风险较小。
2.2 土壤全磷和速效磷与CK相比, CF和CP处理均显著增加土壤全磷含量(P < 0.05), 且CP处理的增幅显著高于CF处理, 这可能是由于在农业生产过程中, 有机肥施用量通常基于作物对氮的需求而计算, 而有机肥氮/磷比值一般小于作物对氮和磷的需求比例, 同时磷肥施入土壤易形成难溶性磷酸盐并迅速被黏土矿物吸附固定, 或被微生物固持, 其当季利用率一般仅为10%~25%, 造成磷的积累。
土壤中速效磷含量可以在一定程度上反映土壤磷的环境风险。如图 2所示, CP处理w(速效磷)达45.88 mg·kg-1, 较CK处理增加11.11倍, 而CF处理较CK处理则降低50.39%, 说明连续过量施用有机肥能导致土壤中速效磷的迅速累积, 尽管有机肥处理土壤速效磷含量远低于CHARMAN等[8]报道的200~300 mg·kg-1的作物毒害浓度, 但是已经非常接近戚瑞生等[9]预测的55.0 mg·kg-1的环境风险值。
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图 2 连续大量施肥对土壤全磷和速效磷含量的影响 Figure 2 Effects of continuous fertilization on total phosphorus and available phosphorus in soil CK为对照, CF为化肥处理, CP为等氮条件下有机肥处理。 直方柱上方英文小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P < 0.05)。 |
如表 3所示, CF处理引起土壤表层重金属含量的增加, 但是较CK处理并未达显著水平。CP处理导致Zn、Cu、Cd和Ni含量显著增加(P < 0.05), 且Cu、Cd和Ni含量已经非常接近GB 15618—1995《土壤环境质量标准》二级标准限值。研究表明畜禽粪肥已成为农业生态系统中Cu、Zn和Cd等重金属的重要来源之一, 在土壤中施用猪粪会导致重金属元素积累, 其对土壤Cu和Zn积累的年贡献率分别达37%~40%和8%~17%[10]。
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表 3 连续大量施肥对土壤重金属含量的影响 Table 3 Effect of continuous fertilization on heavy metal contents in soil |
CP处理土壤中Ni含量显著增加同样可能源于有机肥的逐年大量投入。ACHIBA等[11]曾以牛粪和城市固体废弃物堆肥开展了5 a的田间试验, 发现重金属投入总量是影响土壤重金属含量的关键因素, 尽管牛粪中Ni含量低于土壤本底值, 但是随着有机物质的矿化和营养物质的吸收, Ni元素残留于土壤中, 含量呈现逐渐增加趋势。另外, 笔者并没有检测重金属在水稻或小麦中的含量, 但是土壤重金属总量的增加是引起土壤有效态含量的重要因素, 尽管施用有机肥后土壤pH值有一定程度的提高[12]。
短时间内有机肥的连续大量施用加速了土壤中重金属的累积过程。TIAN等[4]对有机蔬菜种植过程中短期内(4个月)连续施用猪粪有机肥进行环境风险分析, 发现土壤中Cu和Zn含量显著增加。因此, 为了避免有机肥连续施用引发环境问题, 建议通过定位试验方式, 确定不同原料有机肥针对不同土壤和作物类型的投入阈值和投入时间, 并通过种植绿肥、少耕或免耕、秸秆还田和轮作等农艺措施为作物提供营养, 而并非单一的增施有机肥或化学肥料。
2.4 土壤微生物量碳含量(SMBC)和土壤微生物量氮含量(SMBN)SMBC和SMBN是植物营养物质的源和库, 相对于理化指标, 微生物能够更迅速地响应土壤养分或者有毒有害物质的改变。如图 3~4所示, 不同处理SMBC和SMBN含量的变化趋势一致, 均为CP处理>CF处理>CK处理。与CK相比, CF处理SMBC和SMBN分别显著增加19.51%和19.68%。外源营养物质的施入、连续5季植物残体的残留以及土壤结构的改善均是促进微生物数量显著增加的因素, 而此时土壤中重金属含量对微生物的生长繁殖影响是有限的。臧逸飞等[13]研究了长达26 a不同施肥处理农田土壤SMBC和SMBN含量及其调控土壤肥力的作用。长期施肥及种植作物均能提高土壤SMBC和SMBN含量, 尤其是CP处理SMBC和SMBN含量均高于CF处理, 笔者试验结果与之一致。
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图 3 连续大量施肥对土壤微生物量碳含量(SMBC)及SMBC/SOC比值的影响 Figure 3 Effects of continuous fertilization on SMBC and SMBC/SOC ratio CK为对照, CF为化肥处理, CP为等氮条件下有机肥处理。 直方柱上方英文小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P < 0.05)。 |
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图 4 连续大量施肥对土壤微生物量氮含量(SMBN)和SMBN/TN比值的影响 Figure 4 Effects of continuous fertilization on SMBN and SMBN/TN ratio CK为对照, CF为化肥处理, CP为等氮条件下有机肥处理。 直方柱上方英文小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P < 0.05)。 |
SMBC/SOC比值和SMBN/TN比值分别在一定程度上表征土壤中输入的有机质和氮向SMBC和SMBN的转化效率。不同处理SMBC/SOC比值和SMBN/TN比值的变化趋势一致, 为CK处理> CF处理> CP处理, 表明施肥处理SMBC和SMBN含量的增加速率明显低于土壤有机质和TN的增加速率, 这与刘恩科等[14]的研究结果恰恰相反。
刘恩科等[14]发现长期撂荒的土壤SMBC/SOC比值和SMBN/TN比值显著高于农田土壤, 而对于农田土壤来讲, 施肥处理可显著提高土壤SMBC/SOC比值和SMBN/TN比值。这也间接证明了连续大量施肥容易导致营养物质在土壤中的残留和氮利用率下降, 增加环境污染风险, 且CP处理对SMBC/SOC比值和SMBN/TN比值的影响更明显。
2.5 土壤微生物多样性高通量测序技术是解析复杂环境中微生物群落物种组成和多样性的重要工具。选取3个处理的9个土壤样品, 共计获得了313 362条DNA序列, 平均每个样品34 818条, 覆盖率在0.961~0.969之间, 且各样品之间差异不显著, 说明该试验所分析的DNA序列数量足够反映各处理细菌多样性, 且不同处理之间多样性的差异也并非DNA序列数量不足所引起。
香农(Shannon)指数和辛普森(Simpson)指数常用于评价微生物群落多样性。Shannon值越大, 说明环境微生物多样性越高, 而Simpson值越大, 多样性越低[15]。如图 5所示, 尽管3个处理Simpson指数没有显著差异, 但是Shannon指数差异显著(P < 0.05), 表明连续大量施肥显著降低了土壤细菌多样性。WEI等[16]报道土壤微生物多样性越丰富, 农作物抵御病虫害的能力越强, 反之则越弱。
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图 5 连续大量施肥对土壤微生物多样性的影响 Figure 5 Effects of continuous fertilization on soil microbial diversity CK为对照, CF为化肥处理, CP为等氮条件下有机肥处理。 直方柱上方英文小写字母不同表示不同处理间某指标差异显著(P < 0.05)。 |
土壤细菌群落多样性和丰富度都与生态环境相关, 其中土壤pH值是最大的影响因子, 在接近中性的土壤中细菌群落多样性最高, 随着土壤pH值下降, 群落多样性也不断下降[17-18]。CF处理土壤细菌多样性降低可能是由于土壤酸化引起的。CP处理土壤细菌多样性的降低, 可能是由于大量有机物质的投入促进了某一类或某几类微生物的迅速生长或较高水平的重金属元素抑制了部分微生物的繁殖[12, 15]。SUN等[15]对苹果根季土壤微生物多样性的研究同样发现增加畜禽粪便的施用量存在降低细菌多样性的风险。
2.6 土壤病原微生物分析如表 4所示，CF和CP处理对病原微生物相对含量的影响不显著。POULSEN等[19]使用高通量技术评估了城市固体废弃物有机肥应用后病原微生物相对含量的变化, 并且发现有机肥种类不同或施用量不同对土壤中病原微生物相对含量有一定影响。对蔬菜种植条件下猪粪不同施用量病原微生物相对含量进行比较, 发现120和60 t·hm-2猪粪有机肥处理土壤中病原微生物总量明显低于30 t·hm-2处理[4]。另外, 笔者试验土壤中病原微生物的总量(1.87‰~2.05‰)仅为蔬菜土壤的4.5%~8.3%。研究结果的不同可能是由于轮作模式的差异造成的。TIAN等和POULSEN等的大田地块均采用旱-旱轮作, 而笔者试验是在水稻-小麦的水旱轮作系统下进行的, 进一步证明了水旱轮作有利于抑制土壤中病原微生物。较高浓度的NH4+也许是土壤病原微生物相对含量较少的另一原因, 因为TENUTA等[20]发现高浓度NH4+能够显著抑制土壤病原微生物的生长。另外, 笔者试验中每个土壤样品分析得到34 818条DNA序列, 明显高于TIAN等和POULSEN等[19]的分析数量, 能够对相对含量较少的病原微生物做更全面的分析。总的来说, 在稻麦轮作系统中, 肥料的过量施用对病原微生物的影响是可以忽略的。
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表 4 连续大量施肥对可能致病微生物相对含量的影响 Table 4 Effects of continuous fertilization on the relative abundance of possible pathogenic microorganisms |
在稻麦轮作系统中, 与CK相比, CF和CP处理均存在引起环境风险的可能。CF处理容易引起土壤酸化和硝酸盐的大量累积, 而CP处理则容易导致土壤中磷元素和重金属(Zn、Cu、Cd和Ni)含量的显著增加; 另外, CF和CP处理均引起了土壤SMBC/SOC比值和SMBN/TN比值以及细菌多样性的下降, 而对土壤中病原微生物则无显著影响。
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