四环素类抗生素广泛应用于临床和水产养殖, 具有水溶性好、体内代谢后大部分以原形排出、在环境中不易发生生物降解等特点, 从而成为容易在水环境中储存和蓄积的一类抗生素[1]。
苦草(Vallisneria natans)是长江中下游湖泊中常见的沉水植被优势种, 对湖泊生态系统的结构和功能起关键作用[2]。焦少俊等[3]研究了四环素对苦草生长的影响, MOORE等[4]研究了富营养化和光照对大叶藻的联合作用, 叶春等[5]研究了不同总氮浓度对苦草生长的影响。然而, 有关不同营养化水体中氮磷营养盐水平和四环素对苦草联合作用的研究鲜有报道。水体中氮磷浓度影响沉水植物的生长, 残留的四环素也会对生态系统产生一定效应, 研究两者的联合作用, 对于富营养化水体的生物修复以及对四环素类抗生素的管理均具有重要意义。
SOD作为防御活性氧的第一道防线, 主要作用是催化O2-·转化为H2O2, 保护细胞免受损伤, 对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用[6], POD的作用是催化H2O2分解成H2O和O2, 它主要位于细胞质、细胞壁、液泡和细胞外空间, 具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用[7]。笔者在试验室模拟条件下, 通过测定苦草叶片中过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)、可溶性蛋白、叶绿素含量来揭示不同营养化水平和四环素浓度复合水体中苦草的生理生化响应, 以期为水生植物保护和抗生素管理提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料与预培养盐酸四环素(tetracycline hydrochloride)购自Sigma公司, 纯度w为95%。苦草俗称面条草、扁担草、水韭菜等, 属水鳖科(Hydrocharitaceae)苦草属(Vallisneria)多年生沉水植物, 为我国最常见的沉水植物之一, 可从水体中吸收大量营养盐。试验所用苦草购于宿迁花卉市场, 经初步鉴定后清洗干净, 置于培养桶中, 用不含氮、磷的霍格兰稀释培养液预培养7 d。
1.2 试验设计预培养结束后, 选取株高15~20 cm、生长状况良好的苦草种植在50 L的培养桶中, 生物量为75 g·桶-1, 用经盐酸浸泡24 h后清洁至中性的3~4 mm厚的石英砂固定(防止苦草倒伏、死亡), 每桶中装40 L不含氮、磷的霍格兰稀释培养液, 用硝酸钾做氮源, 磷酸氢二钾做磷源, 配制3种氮磷浓度, 氮磷浓度设置参照湖水富营养化标准设定, 分别表示中营养、富营养和超富营养水体。自然环境中, 由于各种原因, 抗生素浓度具有较大的波动性, 所以选用不同浓度进行研究是必要的[1], 四环素的质量浓度梯度为0、0.1、0.2和0.5 mg·L-1, 正交试验设计如表 1所示。
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表 1 不同营养水平和四环素浓度的正交试验设计 Table 1 Orthogonal test of different concentrations of nitrogen, phosphorus and tetracycline hydrochloride |
试验在室温条件下进行, 时间为2016年7月4日至2016年8月4日, 每个浓度设置3个平行, 定期用去离子水补充水分至原始水位, 整个试验中各处理组水体均无藻类滋生, 水体清澈, 苦草生长良好, 生物量有不同程度的增加, 试验结束时取苦草叶片用于分析。
1.3 生理生化指标测定和数据分析可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性和MDA含量均用南京建成生物技术有限公司研制的试剂盒进行测定, 叶绿素含量用分光光度法测定。
用SPSS 20.0软件进行数据统计分析。
2 结果与分析 2.1 苦草可溶性蛋白含量的变化从图 1可知, 同一营养组中不同四环素添加浓度对苦草可溶性蛋白含量的影响不同。中营养组可溶性蛋白含量随四环素浓度的增加呈下降上升再下降的趋势, 但0.1和0.2 mg·L-1四环素处理组蛋白含量变化不显著, 0.5 mg·L-1蛋白含量显著下降。富营养组和超富营养组可溶性蛋白含量均呈先上升后下降的趋势; 富营养组中各四环素处理组蛋白含量变化不显著; 超富营养组中0.5 mg·L-1处理组蛋白含量显著降低。
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图 1 苦草可溶性蛋白含量的变化 Figure 1 Changes in soluble protein content of Vallisneria natans |
在四环素低浓度(0和0.1 mg·L-1)处理组中, 各营养组蛋白含量无显著区别; 在0.2 mg·L-1处理组中, 富营养组蛋白含量与中营养组相比下降不显著, 超富营养组蛋白含量显著降低; 在0.5 mg·L-1处理组中, 富营养组蛋白含量与中营养组相比显著上升, 而超富营养组蛋白含量无显著变化。
不同氮磷营养程度对苦草的单独作用不显著, 四环素对苦草可溶性蛋白含量的影响显著。对比氮磷和四环素的联合作用发现, 超富营养组和0.5 mg·L-1四环素联合作用对苦草可溶性蛋白含量影响最显著, 其含量降至同一营养组中CK处理的47.4%。
2.2 苦草POD活性变化从图 2可以看出, 同一营养组中, 不同四环素浓度对苦草POD活性的影响不同。随着四环素浓度的增大, 中营养组POD活性表现为在0.5 mg·L-1四环素处理组中显著上升; 富营养组、超富营养组POD活性均无显著变化。
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图 2 苦草POD活性的变化 Figure 2 Changes in POD activity of Vallisneria natans |
在低浓度营养组(0和0.1 mg·L-1)组中, 苦草POD活性在中营养组、富营养组及超富营养组间没有显著性差异; 在0.2 mg·L-1四环素处理组中, 不同营养组间苦草POD活性亦无显著性差异; 在0.5 mg·L-1四环素处理组中, 富营养组POD活性与中营养组相比显著降低, 而超富营养组POD活性无显著变化。
氮磷对苦草POD活性的单独作用不显著, 四环素对苦草POD活性的作用显著, 对比氮磷与四环素的联合作用发现中营养组和0.5 mg·L-1四环素联合作用对苦草POD活性影响最显著, 其POD活性为同一营养组CK处理的2.93倍。
2.3 苦草SOD活性变化从图 3可见, 中营养组0.1 mg·L-1四环素处理组SOD活性与CK相比显著下降; 富营养组0.5 mg·L-1处理组SOD活性与CK相比显著下降; 超富营养组0.2和0.5 mg·L-1四环素处理组苦草SOD活性显著上升。
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图 3 苦草SOD活性的变化 Figure 3 Changes in SOD activity of Vallisneria natans |
在CK中, 超富营养组SOD活性与中营养组相比显著降低; 在0.1 mg·L-1四环素处理中, 富营养组和超富营养组SOD活性均显著高于中营养组; 0.2和0.5 mg·L-1四环素处理组, 富营养组和超富营养组SOD活性与中营养组相比均无显著变化。
对比不同浓度氮磷与四环素的联合作用, 发现中营养组和0.1 mg·L-1四环素联合作用对苦草SOD活性有显著抑制作用, 其SOD活性为同一营养组CK处理的62.1%;超富营养组和0.2 mg·L-1四环素的联合作用对SOD活性有显著增强作用, 其SOD活性为同一营养组CK处理的1.45倍。
2.4 苦草MDA含量变化从图 4可见, 在中营养和富营养组, 与CK相比, 各处理组MDA含量均无显著差异; 在超富营养组, 各四环素处理苦草MDA含量与CK相比均显著增加。
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图 4 苦草MDA含量的变化 Figure 4 Changes in content of MDA in Vallisneria natans |
随着营养程度的增加, CK和0.1 mg·L-1四环素处理中, 富营养组、超富营养组苦草MDA含量与中营养组相比无显著差异; 在0.2 mg·L-1四环素处理中, 富营养组、超富营养组苦草MDA含量与中营养组相比无显著差异; 在0.5 mg·L-1四环素处理中, 富营养组MDA含量与中营养组相比无显著差异, 超富营养组显著上升。
氮磷对苦草MDA含量影响不显著, 四环素对苦草MDA含量影响显著。对比氮磷与四环素的联合作用发现超富营养组和0.2 mg·L-1四环素联合作用对苦草MDA含量的影响最显著, 其MDA含量是同一营养组中CK处理的9.63倍。
2.5 苦草Chl含量变化从图 5可见, 同一营养组中, 不同浓度四环素对苦草Chl-a含量的影响不同。在中营养组中, 0.5 mg·L-1四环素处理Chl-a含量与CK相比显著下降; 在富营养组中, 0.2 mg·L-1四环素中Chl-a含量与CK相比无显著差异, 而0.1和0.5 mg·L-1处理中, Chl-a含量都显著降低; 在超富营养组中, 各四环素处理与CK相比Chl-a含量均无显著变化。
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图 5 苦草叶绿素a(Chl-a)含量变化 Figure 5 Changes in content of Chl-a in Vallisneria natans |
随着营养程度的增加, 在0、0.2和0.5 mg·L-1 3组四环素处理中, 富营养组和超富营养组Chl-a含量与中营养组相比无显著变化; 在0.1 mg·L-1四环素组中, 富营养组、超富营养组Chl-a含量与中营养组相比均显著下降。
四环素对苦草Chl-a含量的单独作用亦有显著差异, 对比与四环素的联合作用, 中营养组和0.5 mg·L-1四环素联合作用对苦草Chl-a含量的影响最显著, 其含量是同一营养组中CK处理的75.7%。
从图 6可见, 同一营养组中, 不同四环素浓度对苦草Chl-b含量的影响不同。在中营养组, 0.1 mg·L-1四环素处理Chl-b含量与CK相比下降不显著, 0.2和0.5 mg·L-1四环素处理Chl-b含量显著下降; 在富营养组和超富营养组中, 各四环素处理Chl-b含量与CK相比均无显著变化。
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图 6 苦草叶绿素b(Chl-b)含量变化 Figure 6 Changes in content of Chl-b in Vallisneria natans |
随着营养程度的增加, 在CK处理中, 富营养组Chl-b含量与中营养组相比下降不显著, 超富营养组Chl-b含量显著降低; 在0.1 mg·L-1四环素处理中, 富营养组、超富营养组Chl-b含量与中营养组相比均显著降低; 在0.2和0.5 mg·L-1四环素处理中, 富营养组和超富营养组Chl-b含量与中营养组相比均未发生显著变化。
与Chl-a含量影响相似, 不同营养程度的氮磷对Chl-b的单独作用显著, 四环素对苦草Chl-b含量的单独作用亦显著, 对比氮磷与四环素的联合作用, 中营养组和0.5 mg·L-1四环素联合作用对苦草Chl-b含量的影响最显著, 其含量是同一营养组中CK处理的64.6%。
2.6 交互作用分析交互作用影响指多个变量不同水平相互搭配后对观测变量产生的影响, 例如当变量A从水平A1变为A2, 观测变量值在控制变量B的B1水平上增加, 而在B2水平上却减少, 与控制变量B取B1或取B2有关; 同理, 变量B变化时观测变量值与控制变量A的取值有关, 则表示2个控制变量有交互作用, 否则不具有交互作用。
用SPSS 20.0软件对上述指标进行交互作用分析, 其中, POD、MDA含量没有显著性交互作用(P>0.05), 其P值分别是0.107和0.105;可溶性蛋白、SOD、Chl-a、Chl-b等均有显著性交互作用(P＜0.05), 其P值分别为0.028、0.000 4、0.039和0.045。这表明不同浓度氮磷和四环素对除POD和MDA以外的其他指标的联合作用显著。
3 讨论苦草可以吸收水中的营养物质, 促进水体营养盐降解, 有效净化水质[8], 对恶劣环境有较好的耐受能力[9], 是富营养化水体生态修复的先锋物种[10]。
可溶性蛋白大多是参与各种代谢的酶类, 高含量可溶性蛋白可帮助植物细胞维持较低的渗透势, 抵抗胁迫带来的伤害[11-13]。在超富营养组, 随着四环素浓度的增加, 可溶性蛋白含量略微上升再显著下降, 可能是苦草在四环素耐受范围内耐受能力增强, 诱导产生新的蛋白, 随着四环素浓度超过其耐性阈值, 体内的可溶性蛋白降解, 耐受能力随之显著降低。在中营养组表现出类似的变化规律。POD广泛存在于植物体中, 将H2O2催化还原为O2和H2O, 正常情况下植物体内POD酶活性维持在一定水平, 在氮磷营养盐的单独作用下, 在该研究设置的浓度范围内, POD活性没有显著差异。在富营养和超富营养组内, 不同四环素浓度处理组苦草POD活性与CK相比没有显著变化, 在中营养组中POD活性在不同四环素处理中变化较大, 尤其在中营养与0.5 mg·L-1四环素组合中, POD活性显著升高, 这可能是在中营养与0.5 mg·L-1四环素的联合作用下苦草受到的胁迫最强, 抗氧化酶活性升高。
苦草在逆境下遭受伤害, 会发生膜脂过氧化作用, MDA是膜脂过氧化的最终分解产物, 其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度[14]。前人研究表明, 在氮磷营养盐单独作用下, 在该研究设置的营养盐浓度范围内, MDA含量没有显著差异, 这与笔者研究结果[15]一致。在超富营养组, 各四环素浓度处理MDA含量与CK相比均显著升高, 这表明苦草细胞受自由基攻击较严重, 这可能是高浓度氮磷营养盐与四环素共同作用的结果。
植物叶片的Chl是与其光合能力相关的重要生理指标, 直接影响植物正常的新陈代谢, Chl-a和Chl-b是吸收和传递光能的主要色素。由于水下环境光照较弱, 光强不足, 如果Chl含量高, 则有利于光合作用的提高, 植物生长更加旺盛。前人的研究表明氮磷营养盐浓度与光合体系具有相关性[16-17], 焦少俊等[3]研究表明四环素降低了苦草中Chl含量, 这与该研究的结果一致。
随着四环素浓度增加, 中营养组、富营养组和超富营养组苦草生理生化指标的变化趋势都不尽相同, 这表明不同浓度氮磷和四环素对苦草的联合作用可能存在差异, 两者之间存在的复合作用可能因浓度不同而有所变化。这与前人的研究结果是一致的。污染物与污染物之间、污染物与生物体内各种组分之间都有可能发生不同的交互作用, 导致不同的生态毒理效应[18-19]。
适宜浓度的氮磷营养盐有利于提高苦草的抗逆性, 过高或过低浓度的氮磷营养盐不利于苦草生长, 而四环素也可以通过抑制叶绿体合成酶的活性, 对苦草生长产生抑制作用[20]。在四环素与氮磷营养盐的共同作用下, 苦草的可溶性蛋白含量、SOD活性、Chl-a和Chl-b等生理生化指标受到的影响较单独的氮磷营养盐影响显著, 这表明水体中四环素的存在会增强富营养化水体对苦草的不利影响。相比而言, 富营养组与0.2 mg·L-1四环素的联合作用不显著, 这可能是富营养组氮磷和0.2 mg·L-1四环素之间产生拮抗作用, 这需要进一步的研究加以验证。
在试验结束时同步测定了各处理氮磷营养盐浓度, 以探明苦草生态功能受到的影响, 结果表明, 单独的四环素未对TN去除率产生显著影响(P>0.05), 氮磷与四环素的联合作用也未对苦草TN去除率产生显著影响(P>0.05);但是TP去除率受到单独四环素的影响显著(P＜0.01), 氮磷与四环素的联合作用对苦草TP去除率也产生显著影响(P＜0.05)。这表明水环境中四环素的存在已经影响苦草降解TP生态功能的发挥。综上所述, 笔者认为总氮引起的富营养化在试验设置的四环素浓度范围内(＜0.5 mg·L-1)用苦草进行生物修复是可行的, 其修复效果不会受到四环素影响。
4 结论超富营养组和0.5 mg·L-1联合作用对苦草可溶性蛋白含量影响最显著, 其含量降为同一营养组中CK的47.4%;超富营养组和0.2 mg·L-1四环素的联合作用显著增强SOD活性, 其SOD活性为同一营养组CK的1.45倍。
对于POD活性和MDA含量, 四环素浓度对苦草的单独作用显著, 但四环素与氮磷的联合作用不显著。
中营养组和0.5 mg·L-1四环素联合作用对苦草Chl-a和Chl-b含量的影响最显著, 其Chl-a和Chl-b含量分别是同一营养组中CK组的75.7%和64.6%。
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