双酚A(bisphenol A, BPA)是一种典型的环境内分泌干扰物, 被广泛应用于日用品生产中[1], 在食物、水、车间空气以及人类尿液、血液、母乳中都有检出[2]。研究表明, BPA具有内分泌干扰效应等毒性效应, 会对人体健康造成一定危害, 包括出生缺陷、癌症和早熟等系列健康问题[3-5], BPA暴露的健康危害已经引起社会的广泛关注[6-10]。鉴于此, 加拿大、法国、欧盟等国家和地区已经开始限制含BPA塑料制品的使用, 尤其是对婴幼儿等敏感人群[11-12]。为了应对管制措施, 一些BPA类似物被开发用来替代BPA, 其中常见的有双酚B(bisphenol B, BPB)、双酚AF(bisphenol AF, BPAF)、双酚F(bisphenol F, BPF)、双酚S(bisphenol S, BPS)、双酚AP〔4, 4′-(1-Phenylethylidene) biphenol, BPAP〕、双酚Z(bisphenol Z, BPZ)和双酚P(bisphenol P, BPP)。
研究表明, BPA类似物不仅对生物具有急、慢性毒性效应, 而且具有内分泌干扰毒性效应。STOUT[13]对未发育完全的雌性大鼠连续3 d皮下注射100 mg·kg-1 BPAF后, 发现其子宫大小比正常大鼠增大337%。LI等[14]通过荧光素酶报告基因研究BPAF的转录活性, 发现BPAF可以通过基因和非基因途径激活人的乳腺癌细胞, 从而刺激内源性雌激素响应基因的转录。CABATON等[15]通过体外人体细胞系和彗星试验研究发现, BPF对人体细胞系尤其是HepG2细胞的基因毒性和内分泌活性远远高于4, 4′-二羟基二苯甲酮(DHB)和羟基化BPF(BPF-OH), 并且在10-5mol·L-1时就具有抗雄激素效应。SONG等[16]以斑马鱼的胚胎和幼鱼为模式生物研究四溴双酚A (TBBPA)、四氯双酚A (TCBPA)和BPAF这3种卤代双酚A类似物的发育毒性, 半致死浓度值LC50的计算结果表明其毒性大小为TCBPA> TBBPA> BPAF, 3种物质均会导致胚胎和幼鱼的发育病变, 如延迟孵化、水肿和出血等, 通过体内卵黄蛋白原(vtg)测定和体外MVLN试验发现, BPAF表现出比BPA更强的雌激素效应。
研究表明, 由于内分泌干扰物(BPA)与某些生物体内激素的结构相似, 可能与激素受体蛋白结合, 形成配体-受体复合物, 再与DNA结合区的反应元件结合, 影响人和动物的内分泌系统; 内分泌干扰物可以与生物体内的激素相互竞争结合, 从而减少受体与生物体内的激素结合, 影响激素信号在细胞、器官和组织中的传递, 导致机体功能失调[17]。受体报告基因试验是美国环保署(USEPA)推荐的体外检测方法之一, 以受体介导为基础, 应用基因重组技术, 将报告基因置于外源性激素反应元件调控之下, 构建重组报告基因质粒, 应用基因转染技术导入哺乳动物细胞内, 通过检测报告基因编码的酶活性或蛋白表达的变化, 间接反映环境内分泌干扰物(EDCs)作用下内源性基因的表达情况。
目前针对BPA类似物内分泌干扰效应的报道还较少, 笔者开展基于非洲猴肾细胞(CV-1) 核受体介导的报告基因试验, 研究BPA类似物对雌激素受体的干扰作用, 为BPA类似物内分泌干扰效应的生态风险评价提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 细胞与质粒CV-1细胞购于中国医学科学院上海分院细胞研究所; pERE-TATA-Luc和rERa/pCI为日本Takeyoshi Masahiro博士馈赠, 感受态E.Colo Ⅰ DH5a购于北京全式金生物实验技术有限公司。
1.2 仪器与试剂CO2培养箱为美国Thermo C0150产品, 超净工作台为三德医疗器械(南京)有限公司产品, 台式高速低温离心机为上海翼控机电有限公司产品, Berthold LB960化学发光检测仪为德国Berthold公司产品, 超微量分光光度计购自美国Quawell公司, 24孔板、细胞冻存管为美国康宁公司产品, 青霉素-链霉素溶液、Ampicilin和质粒提取试剂盒为北京全式金生物技术有限公司产品, 无酚红DMEM培养基、胎牛血清为美国Gibco公司产品, Sofast转染试剂购自太阳马生物工程有限公司, 萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒购自碧云天公司; 雌二醇(AR, w=98.0%)、己烯雌酚(AR, w=99.0%)、木黄酮(AR, w=99.0%)、双酚A(w=98.5%)、双酚B(w>98.0%)、双酚S(w>98.0%)、双酚Z(w=98.0%)、双酚AF(w=98.0%)、双酚F(w>99.0%)、双酚P(w=99.0%)、双酚AP(w>98.0%)均购于百灵威(上海)化学技术有限公司, 乙醇购于南京化学试剂有限公司。
1.3 质粒的获取与鉴定将pERE-TATA-Luc和rERa/pCI转化至E.Colo Ⅰ DH5a, 37 ℃正面培养1 h后倒置培养过夜。挑选LB平板形成的阳性单菌落接种到含50 μg·mL-1氨苄青霉素(AMP)的LB培养基中扩增, 以280 r·min-1振荡培养12 h, 应用质粒提取试剂盒提取质粒, 通过DNA序列测定对比分析鉴定重组质粒基因的正确性, 并测定浓度。
1.4 质粒转染CV-1细胞CV-1细胞用DMEM培养基(青、链霉素各100 μg·mL-1, 庆大霉素50 μg·mL-1, φ=10%的胎牛血清, pH值7.1), 在37 ℃、φ=5%的CO2培养箱中进行培养, 当细胞生长至80%满瓶时, 用2.5 g·L-1胰酶〔不含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化液消化细胞, 用不含酚红的杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)重悬, 按每孔105细胞量接种到24孔板中, 培养液的加入量为0.5 mL, 在37 ℃、φ=5%的CO2培养箱中培养12 h, 使细胞密度达70%~80%。
通过核酸测定仪测定质粒浓度, 取0.5 μg pERE-TATA-Luc和0.2 μg rERa/pCI稀释于30 μL PBS缓冲液中, 轻轻混匀后, 作为A液; 取1 μL Sofast转染试剂稀释于30 μL PBS缓冲液中, 轻轻混匀后, 作为B液; 将B液滴加到A液中, 边滴加边涡旋, 充分混匀, 作为A+B混合液, 室温孵育20 min; 轻轻摇动后, 将A+B混合液滴加到24孔板中, 混合液与培养基均匀混合后, 在37 ℃、φ=5%的CO2培养箱中培养12 h后, 加入受试物进行染毒。
1.5 受试物染毒吸去24孔板中的转染液, 加入不同剂量的雌二醇(E2)、乙烯雌酚、木黄酮, 浓度范围为10-12~10-8 mol·L-1, 10倍浓度间隔; 双酚A、双酚B、双酚S、双酚Z、双酚AF、双酚F、双酚P和双酚AP浓度范围为10-7~10-4 mol·L-1, 1.1倍浓度间隔, 以φ=0.1%的无水乙醇作为空白对照, 各剂量均设3个复孔, 检测荧光酶活性, 以3次荧光素酶诱导倍数的平均值作为各处理组Luc荧光值, 通过剂量-效应曲线计算半数有效浓度EC50。
通过10-9 mol·L-1的E2在同一板内、不同板间、多代细胞(3代和20代)的诱导作用进行重复性试验。
1.6 细胞裂解及报告基因检测吸去24孔板中的培养液, 用PBS 1×缓冲液洗细胞2次, 用枪头将PBS吸干净, 尽量不丢失细胞; 每孔加入1×被动裂解缓冲液(PLB) 200 μL, 轻轻晃动培养板保证所有的细胞都被覆盖; 室温下, 在脱色摇床上轻轻晃动培养板, 孵育15 min; 用枪头轻刮培养板的表面, 倾斜培养板, 将细胞完全刮到培养板的低处, 将细胞裂解液转移到1.5 mL离心管中, 旋涡混匀10~15 s; 4 ℃条件下, 以相对离心力12 000 g离心2 min, 将上清液转移到另一干净的离心管中; 采用专用96孔非透明板, 每孔加入100 μL细胞裂解液和100 μL荧光素酶检测试剂, 混匀, 采用化学发光检测仪检测。
1.7 统计分析Luc诱导活性以受试物的Luc表达相对于溶剂对照组Luc表达的倍数表示, Luc诱导倍数=染毒组Luc值/溶剂对照组Luc值。
2 结果与分析 2.1 质粒的鉴定结果5′-GGTACCAAAG TCAGGT CACA GTGACCTGAT CAAAAGTCAG GTCACAGTGACCTGATCAAA AGTCAGGTCA CAGTGACCTG ATCAGAGCTC-3′为报告基因重组质粒pERE-TATA-Luc的引物, 质粒扩增之后, 通过DNA序列鉴定重组质粒基因序列的正确性(匹配度=100%), 结果如图 1所示。
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图 1 pERE-TATA-Luc的DNA序列鉴定 Figure 1 DNA sequencing of pERE-TATA-Luc |
受体表达质粒rERa/pCI经质粒扩增之后, 通过DNA序列鉴定重组质粒基因序列的正确性(匹配度=97%), 结果如图 2所示。
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图 2 rERa / pCI的DNA序列鉴定 Figure 2 DNA sequencing of rERa / pCI |
DNA序列分析显示, 在构建质粒的多克隆位点内成功插入了ERE片段, 说明pERE-TATA-Luc为准确质粒; 受体表达质粒rERa/pCI的序列与扩增质粒序列匹对成功, 说明rERa/pCI也为准确质粒。
2.2 体外细胞检测体系的验证 2.2.1 有效性验证结果在转染雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-Luc的情况下给予不同浓度的E2, 检测报告基因的表达。结果显示, E2与荧光素酶的表达存在显著的剂量-反应关系。在未转染雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-TATA-Luc的情况下，同样给予不同浓度的E2, 检测报告基因的表达, 结果显示, 报告基因的表达无明显变化, 与pERE-TATA-Luc存在时差异明显(图 3)。
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图 3 E2对转染细胞报告基因表达结果的影响 Figure 3 Effect of E2 on expression of reporter gene in transfected cells |
对共转染雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-TATA-Luc和受体质粒rERa/pCI的CV-1细胞, 给予不同浓度(10-12~10-8 mol·L-1)的E2, 检测报告基因的表达。结果显示, E2与荧光素酶的表达存在显著的剂量-反应关系, 从10-11 mol·L-1起表达开始增强, 在10-9 mol·L-1时达最大值, EC50值为6.1×10-11 mol·L-1。SUN等[18]研究结果显示, E2的EC50值为4.7×10-9 mol·L-1；赵海涛等[19]研究结果显示, MCF-7细胞E2的EC50值为5×10-11 mol·L-1。可见, 笔者研究的CV-1细胞受体报告基因试验具有较高的灵敏性。己烯雌酚是人工合成的非甾体类药用雌激素, 有报道称己烯雌酚是除雌二醇以外最强的环境雌激素样化合物[20]。检测发现, 己烯雌酚从10-11 mol·L-1起表达开始增强, 在10-7 mol·L-1时达最大值, EC50值为2.4×10-11 mol·L-1, 在哺乳动物细胞中己烯雌酚的雌激素活性大于雌二醇, 与COLDHAM等[20]研究结果一致。此外, 检测发现木黄酮有微弱的雌激素活性, 这与木黄酮的结构和雌二醇相似有关, 可以补充人类雌激素的不足。由图 4可见, 这3种化合物雌激素活性大小为己烯雌酚(CAS号为6898-97-1)>雌二醇(CAS号为50-28-2)>木黄酮(CAS号为446-72-0)。
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图 4 己烯雌酚、雌二醇和木黄酮的雌激素活性 Figure 4 Estrogenic activities of diethylstilbestrol, estradiol and genistein |
CV-1细胞转染质粒pERE-TATA-Luc和rERa/pCI后, 以10-9 mol·L-1的E2进行染毒, 在同一块24孔板设置3个复孔, 测定E2对Luc的诱导作用, 板内变异系数为8.7%;另外, 10-9mol·L-1的E2在不同板间测定3次, 板间变异系数为10.6%。
通过重复性试验, 多代细胞(3代和20代)培养对比荧光素酶的诱导, 结果(表 1)显示, CV-1细胞报告基因试验具有较好的稳定性。因此, 该研究建立的CV-1细胞受体报告基因试验可用于双酚A类似物的雌激素效应的研究。
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表 1 重复性试验结果 Table 1 Results of repeatability test |
双酚A、双酚B、双酚AF、双酚F、双酚S、双酚AP、双酚Z和双酚P这8种双酚A类似物的分子结构和雌激素效应有效浓度EC50如表 2所示。
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表 2 8种双酚A类似物的结构和半数效应有效浓度 Table 2 Structures and half effective concentration of 8 bisphenol A analogues |
根据8种化合物的剂量-效应曲线计算了8种双酚A类似物的EC50值。从图 5可以看出, BPAF的荧光素酶诱导效应最高, EC50值为1.5×10-6 mol·L-1, 其次是BPF, EC50值为1.6×10-6 mol·L-1, BPB的EC50值为5.5×10-6 mol·L-1, BPAP、BPS和BPP荧光素酶诱导能力较弱, EC50值分别为1.1×10-7、5.4×10-6和3.3×10-6 mol·L-1。如表 2所示, 响应值较高的BPAF、BPF、BPB和BPA的荧光素酶诱导能力分别为E2对照的81.5%、73.7%、62.7%与57.9%, BPZ、BPAP、BPS和BPP诱导荧光色酶均未达到E2对照的50%。因此, 8种双酚A化合物雌激素活性大小顺序为BPAF> BPF> BPB> BPA> BPZ> BPAP> BPS> BPP。
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图 5 8种双酚A类似物的雌激素活性 Figure 5 Estrogenic activities of 8 bisphenol A analogues |
其中, BPAF由于BPA中的丙烷基被疏水基团氟原子取代, 碳桥上烷基被三氟取代, 表现出了最强的雌激素活性, 这可能与氟取代后甲基位置的亲水性大大增加有关[21]。MATSUSHIMA等[22]开展的体外细胞试验结果显示, BPAF与雌激素受体α(ERα)的亲和力高于BPA, 雌激素活性更强, 笔者的研究结果与其基本一致。取代基数目减少和取代基的大小也会影响雌激素的活性, 如BPF碳桥上没有甲基, BPA碳桥上有2个甲基, 导致BPF的雌激素活性大于BPA。BPAP碳桥上甲基被苯环取代, BPZ碳桥上甲基被环己烷取代, 导致其雌激素活性均小于BPA。梁栋[23]通过雌激素受体调控的荧光色素酶基因表达比较BPA和BPF的雌激素活性, 笔者的研究结果与其基本一致。
3 讨论与结论受体介导理论是雌激素受体(ER)报告基因试验的理论基础, 尚无统一的标准方法, 其差别包括细胞株、受体表达质粒、报告基因、转染方法和激动剂或拮抗剂的阳性对照等。研究认为各实验室可以根据具体情况, 选择并建立合适的ER报告基因实验。酵母表达系统虽然能够有效筛选ER激动剂, 但缺乏对拮抗剂的检出效力, 因此基于哺乳动物细胞的ER报告基因试验在内分泌干扰物研究中得到广泛关注和快速发展。CV-1细胞具有易于培养、条件便于控制、培养成本较低等优点, 背景值比MCF-7细胞低, 可用于多种试验。
笔者构建雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-TATA-Luc和受体质粒rERa/pCI共转入CV-1细胞, 从而使转染细胞可与具有雌激素效应的化学物质反应, 引起Luc荧光素酶的表达。以雌二醇作为阳性对照物验证检测系统的有效性, 结果显示, 在转染雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-TATA-Luc的情况下, E2与荧光素酶的表达存在显著的剂量-反应关系, 而未转染雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-TATA-Luc的情况下不能引起Luc报告基因的表达。从E2浓度为10-11 mol·L-1起表达开始增强, 在10-9 mol·L-1时达最大值, EC50值为6.1×10-11 mol·L-1, 与其他研究学者建立的细胞系相比具有较好的灵敏性。重复性试验显示, CV-1细胞受体报告基因试验具有较好的稳定性。
基于非洲猴肾CV-1细胞受体报告基因试验, 研究了双酚A类似物拟雌激素干扰活性, 雌激素活性表现为BPAF> BPF> BPB> BPA> BPZ> BPAP> BPS> BPP。CV-1细胞受体报告基因试验是一种筛选雌激素活性内分泌干扰物的快速、有效的方法。
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