2. 南京农业大学无锡渔业学院, 江苏 无锡 214081;
3. 农业部水产品质量安全控制重点实验室, 北京 100141
2. Wuxi Fishery College of Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081, China;
3. Key Laboratory of Quality and Safety Control for Aquatic Products, Ministry of Agriculture, Beijing 100141, China
吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)是1993年后在菲律宾利用尼罗罗非鱼的4个非洲品系和4个亚洲品系等广泛的优良种质资源选育而成的新品种, 目前该品种已在海南、广东、广西、云南及苏北地区大量养殖, 已被诸多学者作为试验鱼类使用[1]。水体富营养化指水体中N、P等营养盐含量过多而引起的水质污染现象[2], 池塘养殖水体富营养化尤为严重, 采用循环水和种植水上植物是水质净化最常见的方式之一[3-4]。近几年来, 水上种植中草药已被广泛用于调控池塘水质和增强鱼类免疫能力, 优点主要在于中草药能治疗(或预防)鱼类的单殖吸虫等疾病[5], 且种植获得的中草药重金属污染小。鱼腥草(Houttuynia cordata)生长于阴湿处或山涧边, 在中国中部、东南至西南部各省区有大量种植, 研究表明浮床栽培鱼腥草不仅可以改善罗非鱼池塘水质指标, 还可明显提高吉富罗非鱼非特异免疫能力。
在鱼类免疫反应中, 胸腺和血液分别主要用于产生和运输淋巴细胞, 其增殖过程会产生免疫因子介导免疫反应。免疫反应可分为免疫识别、细胞因子增殖和效应阶段。在免疫识别中, 免疫球蛋白(immunoglobulin M, IgM)是鱼类适应性体液免疫应答中最主要的介质[6]; 表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)刺激胸腺再生, 加快淋巴T/B及吞噬细胞的生成(吞噬病毒病菌和癌细胞), 提高机体免疫功能[7]。炎症反应实质上是机体与促炎因子进行抗争的反映, 炎症相关因子包括促炎因子(proinflammatory cytokines)和抗炎因子(antiinflammatory cytokines)。在炎症细胞因子增殖阶段, 抗炎因子干扰素-γ(interferon γ, IFN-γ)和白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10) 分别在抗病毒感染、皮肤免疫和免疫功能调节中发挥重要作用[8], 且后者是前者的抑制子[9]。促炎症因子中, 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)是一种能杀伤某些肿瘤细胞并使体内肿瘤组织发生坏死的因子[10], 而白细胞介素-8(interleukin-8, IL-8) 嗜中性粒细胞因子, 是炎症性疾病的重要介质, 在抗感染、免疫反应调节以及抗肿瘤方面有重要作用。研究表明虹鳟肠黏膜组织中存在能够合成IL-8、TNF-α和IFN-γ的功能细胞[11], 用于抗菌、抗病毒等免疫反应中。在炎症反应效应阶段的诸多抗菌免疫因子中, 金属硫蛋白(metallothionein, MT)能够调节机体必需重金属的稳态及对有害重金属进行解毒, 并起氧化应激防护作用[12]; 转铁蛋白(transferrin, TRF)负责机体中Fe3+在吸收、储存和利用部位间的传递[13]。
针对鱼腥草-罗非鱼共生这一实例, 探究种植鱼腥草后其对吉富罗非鱼血清不同免疫应答阶段几种免疫因子的影响, 旨在从增强鱼类免疫角度为鱼腥草-罗非鱼共生体系的应用前景及推广提供数据支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料与设计试验基地为中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴屺亭养殖基地。每口试验用池塘面积为1 333 m2, 水深1.5 m, 并配备微孔增氧系统。养殖品种为“新吉富”罗非鱼越冬种, 平均投放规格为(42±2.1) g·尾-1, 养殖密度为1 750尾·(667 m2)-1, 同时搭配少量滤食性鲢(20尾·塘-1)、鳙(30尾·塘-1)。浮床植物选用鱼腥草, 试验分4口塘进行种植, 浮床面积占池塘面积比例分别为0、5%、10%和15%(图 1)。试验于2015年5月开始, 至10月结束。每天8:00定量投喂1次, 饲料为天邦罗非鱼膨化料(编号5532、5533、5534、5536), 饲料投喂量为鱼体质量的3%。养殖期间的病害防控及日常管理基本一致, 除池塘水分渗漏、蒸发补水外, 养殖过程中池塘不换水。
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图 1 鱼腥草对吉富罗非鱼免疫识别阶段血清免疫因子的影响 Figure 1 Effect of cultivation of Houttuynia cordata on floating bed on serumal immunological factors of Oreochromis niloticus in the pond 同一幅图中直方柱上方英文小写字母不同表示不同处理组间某指标差异显著(P < 0.05)。 |
试验选用PVC管材料(Φ=50 mm)制作浮床, 规格为2 m×2 m。浮床两面分别用网孔为30 mm(便于鱼腥草扦插)的网片包裹。试验开始前, 将预先培育好的鱼腥草苗(株高20 cm), 按株距30 cm×行距20 cm进行扦插, 种植前根茎和叶总质量在43~129 g·m-2之间, 收割后根茎和叶总质量在173~519 g·m-2之间, 浮床集中固定在池塘中排列整齐, 每3个浮床用尼龙绳连接成组。
1.2 不同阶段几种免疫因子测定试验结束后, 从每个处理组中随机挑选30尾鱼〔体质量(772.6±6.7) g, 体长(316.0±4.6) mm〕, 采集吉富罗非鱼血液, 冰箱中静置24 h, 3 000 r·min-1离心5 min(离心半径为3 cm)后得到血清上清。免疫应答不同阶段几种免疫指标包括:(1) 免疫识别:免疫球蛋白(IgM, 检测范围0.05~10 mg·mL-1)、表皮生长因子(EGF, 检测范围5~2 000 ng·L-1); (2) 炎症反应:干扰素-γ(IFN-γ, 检测范围5~1 000 ng·L-1)、白细胞介素-10(IL-10, 检测范围2~600 ng·L-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α, 检测范围3~900 ng·L-1)、白细胞介素-8(IL-8, 检测范围0.5~200 ng·L-1); (3) 效应阶段:金属硫蛋白(MT, 检测范围0.05~20 ng·mL-1)和转铁蛋白(TRF, 检测范围5~2 000 mg·L-1), 其测定方法均按酶联免疫试剂盒说明书进行, 试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。
1.3 统计学分析数据结果均用“X ± SD”表示, 采用SPSS 11.0软件中单因素方差分析对数据进行显著性检验(LSD法), 显著性水平设为0.05。
2 结果与对照组相比，5%、10%和15%鱼腥草处理组吉富罗非鱼血清IgM含量显著提高(图 1, P < 0.05)。5%、10%和15%处理组吉富罗非鱼血清EGF含量均显著高于对照组, 5%处理组EGF含量显著低于10%处理组, 但显著高于15%处理组(P < 0.05)。
与对照组相比, 5%、10%处理组吉富罗非鱼血清IFN-γ含量显著提高(图 2), 且5%处理组显著高于10%处理组。鱼腥草处理组吉富罗非鱼血清IL-10含量均显著高于对照组, 且5%处理组显著低于10%处理组, 显著高于15%处理组。与对照组相比, 5%、15%处理组吉富罗非鱼血清TNF-α含量均显著降低, 但10%处理组吉富罗非鱼血清TNF-α含量显著高于对照组。鱼腥草处理组吉富罗非鱼血清IL-8含量均显著提高, 且5%处理组显著低于10%处理组, 显著高于15%处理组。
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图 2 鱼腥草对吉富罗非鱼炎症反应阶段血清炎症因子的影响 Figure 2 Effect of cultivationof Houttuynia cordata on floating beds on serumal inflammation factors of Oreochromis niloticus at the breeding phase 同一幅图中直方柱上方英文小写字母不同表示不同处理组间某指标差异显著(P < 0.05)。 |
与对照组相比，10%和15%处理组吉富罗非鱼血清MT含量显著降低(图 3), 5%处理组与对照组没有显著差异。鱼腥草处理组均显著提高吉富罗非鱼血清TRF含量, 且5%处理组TRF含量显著低于10%处理组, 并显著高于15%处理组。
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图 3 鱼腥草对吉富罗非鱼效应阶段血清免疫因子的影响 Figure 3 Effect of cultivation with Houttuynia cordata on floating beds on serumal immunological factors of Oreochromis niloticus at the effect phase 同一幅图中直方柱上方英文小写字母不同表示不同处理组间某指标差异显著(P < 0.05)。 |
鱼类参加免疫应答的细胞主要有巨噬细胞和淋巴细胞, 这些免疫细胞产生的细胞因子包括免疫识别阶段的IgM(免疫应答)、EGF(促免疫细胞分化); 炎症反应相关的因子, 如白细胞介素(参与免疫和炎症过程)、IFN-γ(参与免疫调节)和TNF-α(参与机体免疫调节, 巨噬细胞活化)等。炎症反应相关的免疫因子之间能相互作用(如彼此间提供胞内信号)[14], 如IFN-γ、TNF-α和白细胞介素共同参与促或抗炎症反应。研究表明鱼体在受到毒物(草甘膦)污染时, 草鱼IFN-γ、IL-1β(IL-1亚型)和TNF-α含量改变进而破坏鱼类非特异性免疫能力[15]。该研究中, 5%鱼腥草处理组吉富罗非鱼血清IgM、IFN-γ含量显著高于其他处理组和对照组; 10%鱼腥草组血清EGF、IL-8、IL-10、TNF-α和TRF含量显著高于其他处理组和对照组, 这与之前的结果[15]相类似, 与虹鳟受到病原菌(黄杆菌，Flavobacterium psychrophilum)感染时免疫器官中MT、IL1β和TNF-β基因表达量显著改变的结果[16]相类似, 一方面表明鱼腥草种植后改变了吉富罗非鱼血清中免疫因子含量, 此外, 这些均说明鱼类免疫系统虽不如其他高等动物健全, 但鱼体在自身健康受到威胁时, 不同阶段的免疫因子可能会呈现不同的响应。至于促炎和抗炎因子之间如何平衡和调控[9, 17], 尚需要进一步研究。
吉富罗非鱼养殖池塘中种植鱼腥草起到增强鱼类免疫作用，可能主要是通过改善水质、释放抗菌物质和根部被罗非鱼啃食增强鱼类免疫能力来实现。在水质改善方面, 课题组的早期研究结果表明, 吉富罗非鱼在低浓度氨氮和亚硝酸盐氮胁迫下, 鱼自身机体采取一种主动调节措施; 但随着氨氮和亚硝酸盐氮浓度的升高, 一些免疫相关酶活性(以氧化应激等为主)则呈下降趋势[18]。大菱鲆在氨氮胁迫下MT、促炎症因子(TNF-α和IL-1β)基因表达量显著上升, 但IgM和IGF-1基因表达量显著下降[19]。10%鱼腥草处理组促炎症因子(TNF-α和IL-10) 含量最高, 且10%鱼腥草处理组炎症抑制因子(IFN-γ)显著低于5%鱼腥草处理组, 说明较低种植面积的鱼腥草(5%)就能刺激鱼体巨噬细胞产生细胞因子, 介导各种免疫反应。此外, 5%鱼腥草处理组血清IgM、EGF、TRF含量升高, MT含量没有显著降低, 且TNF-α含量显著降低(图 2)。这说明5%鱼腥草种植能在不激发炎症反应的同时, 在免疫识别和效应阶段增强鱼类的免疫能力。
鱼腥草根部释放的化感物质如何提高吉富罗非鱼的免疫能力？如何与免疫因子进行互作？在吞食鱼腥草根系的情况下, 吉富罗非鱼如何提高其自身免疫能力?这些都是值得进行进一步研究的课题, 这些研究将为开发池塘综合种养技术提供新的思路。
4 结论10%鱼腥草处理组吉富罗非鱼血清EGF、IL-8、IL-10、TNF-α和TRF含量显著高于其他处理组和对照组, 5%鱼腥草处理组吉富罗非鱼血清IgM、IFN-γ含量显著高于其他处理组和对照组。吉富罗非鱼养殖池塘5%鱼腥草种植面积能显著提高不同免疫阶段血清免疫因子活性的含量。
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