2. 研究生学院, 吉林 132000
2. Graduate College, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132000, China
厕所改革是乡村文明建设的重要标志,是改善农村人居环境、实现新农村建设的关键工程[1]。而将传统旱厕改成水冲厕时,粪水如果不能进行有效的收集和处理,将会危害农村的饮用水安全及居民的健康。与此同时,随着农村经济的发展和农民生活水平的提高,农村生活污水的排水量日益增大,污染物的种类变得复杂,污染物浓度出现增长趋势。数据表明[2],全国农村每年产生生活污水约80多亿吨,占全国污水污染物排放量的50%以上,而96%的农村没有有效的处理措施,污水随意排放,造成地表水与地下水的严重污染。农村水污染已成为我国水污染的重要组成部分,农村污水治理迫在眉睫。
我国南北方农村地区地域和经济水平差别较大,农村污水处理也呈现不同方式。目前,农村污水处理主要有两种模式:一种是集中处理模式,另一种是分散处理模式。集中处理模式受乡村经济发展水平、自然环境、人口规模及密度等因素影响;分散处理模式技术种类多样,可分为利用土壤、水体的自然生态处理系统和人工生物处理系统[3]。在人工生物处理中,一体化集中装置处理技术能够更好地与农村厕改相适应[4]。在北方地区,由于冬季较长,气温低,利用生物处理污水的效果往往受到季节限制。耐冷菌由于可在最低温度-5~0 ℃及最高温度高于20 ℃下生长繁殖[5],能够较好地适应北方地区的气候特征,由于其独特的耐冷特性,已成为低温污水处理领域的研究热点[6-7]。在北方城镇污水处理系统中投加耐冷菌能强化冬季污水的处理效果,节省设备投资和能耗[8]。Wang等[9]向sequencing batch reactor activated sludge process(SBR)系统中投加生物强化耐冷菌剂,系统的化学需氧量(chemical oxygen demand,COD)平均去除率由78.97%增加至91.72%,缩短了系统启动时间,降低了运行成本。而在一体化集中处理装置中,利用耐冷菌处理农村生活污水的研究较少。因此,选育合适的低温污泥或低温微生物,将为北方地区农村污水实现冬季正常且低能耗处理提供一种颇具优势的解决方案。
本文从低温驯化污泥中分离纯化耐冷菌,利用人工污水降解实验比较分离菌株的低温降解性能,从中筛选出具有较好处理效果的菌株,研究其低温生长性能并利用分子生物学方法对其进行鉴定。通过比较低温和常温下菌株对模拟农村生活污水COD的去除情况,考察耐冷菌在低温条件下的污水处理性能。之后将各菌株按不同体积比混合,考察混合菌对农村实际生活污水的处理效果,并按照最优配比将混合菌制成菌剂,考察其在低温下对实际农村生活污水的处理效果,结果表明出水COD可达到我国农田灌溉水质标准。
1 材料与方法 1.1 实验材料菌种:吉林某污水处理厂污泥,经8 ℃低温驯化,利用平板涂布和平板划线方法从中分离耐低温菌。
富集培养基:葡萄糖,8.0 g;蛋白胨,1.5 g;K2HPO4,0.4 g;(NH4)2SO4,0.5 g;MgSO4·7H2O,0.05 g;CaCl2,0.10 g;FeCl3,0.01 g;MgCl2,0.10 g;酵母膏,1.5 g;NaCl,3.0 g;L-半胱氨酸,0.5 g;蒸馏水,1 L。固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂粉。
人工污水[10]:葡萄糖,0.17 g;可溶性淀粉,0.16 g;乙酸钠,0.23 g;蛋白胨,0.15 g;牛肉膏,0.04 g;NH4Cl,0.26 g;(NH4)2SO4,0.03 g;KH2PO4,0.07 g;Na2CO3,0.06 g;自来水,1 L。其COD约为650 mg/L。
模拟农村生活污水:蛋白胨,0.10 g;可溶性淀粉,0.25 g;洗洁精,0.10 g;食用油,0.20 g;羧甲基纤维素钠,0.05 g;NaCl,0.05 g;KH2PO4,0.05 g;CaCl2,0.02 g;MgSO4·7H2O,0.02 g;自来水,1 L。其COD约为700 mg/L。
实际农村生活污水:舒兰市农村厕改工程农户化粪池污水。其COD约为550 mg/L。
以上试剂中,酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、L-半胱氨酸、琼脂粉,北京奥博星生物技术有限责任公司;洗洁精,上海白猫;食用油,金龙鱼调和油;其余试剂均为分析纯,由天津市大茂化学试剂厂生产。
1.2 主要设备紫外可见分光光度计,UV2600型,贵州赛兰博科学仪器有限责任公司;显微镜,BA2303i型,上海光学仪器一厂;多参数水质测定仪,5B-3B型,多参数消解仪,LH-25A型,北京连华科技有限公司;生化培养箱,LRH-800F型,上海一恒科学仪器有限公司;全恒温振荡培养箱,ZQPW-70型,常州金坛精达仪器制造有限公司;洁净工作台,SW-CJ-2FD型,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;灭菌锅,YXQ-LS型,上海博讯实业有限公司医疗设备厂。
1.3 实验方法 1.3.1 耐冷菌的筛选将低温驯化污泥按5%(体积分数)的比例加入无菌生理盐水中,混匀,取1 mL加入25 mL富集培养基中,在10 ℃、120 r/min的摇床中培养,用富集平板对培养液进行耐冷菌的分离纯化。将分离出的耐冷菌接种至富集培养基中,待培养液吸光度值为0.1时,按体积分数1%接种至200 mL人工污水中,置于10 ℃培养箱中定时摇动,培养4 d后测上层液的COD,选择COD去除效果较好的耐低温菌株。
1.3.2 耐冷菌的鉴定利用分子生物学手段[11]对8株COD去除效果较好的耐冷菌进行菌种鉴定。取适量菌体溶于50 μL微生物裂解缓冲液(TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism)中,变性后离心取上清作为模板(Template DNA)。
Polymerase chain reaction(PCR)扩增:以27F和1492R为引物,序列分别为5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′,使用ABI公司3730XL型DNA测序仪进行测序,PCR产物以1%(体积分数)琼脂糖凝胶电泳检测,进一步纯化后将所获得的基因序列在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上用basic local alignment search tool(BLAST)进行同源检测。
1.3.3 耐冷菌生长曲线的测定将筛选出的优势低温菌以接种量0.2%(体积分数)接种至100 mL富集培养基,在10 ℃、150 r/min摇床中培养5 d。以未接种的培养基为空白样,每隔12 h测吸光度值(OD600),以培养时间为横坐标,OD600为纵坐标绘制耐冷菌的生长曲线,实验重复3次,数据均采用Origin 2018进行分析作图处理。
1.3.4 耐冷菌污水降解性能的测定将筛选出的优势耐冷菌活化36 h,用无菌水调节各菌液的OD600为1.0,然后取5 mL菌液在8 000 r/min转速下离心10 min,弃去清液,将沉淀加入已灭菌的200 mL模拟农村生活污水中及200 mL实际农村污水中,10 ℃下培养,定时摇动,静置后每24 h测上层液COD,直至污水的COD降至150 mg/L左右。在25 ℃下用同样的方法处理模拟农村生活污水,比较耐冷菌在低温和常温下的污水降解性能。所有实验重复3次。
1.3.5 混合耐冷菌及制备菌剂对实际农村污水处理效果表征根据单株耐冷菌对模拟农村生活污水及实际农村污水的处理效果,考察混菌作用对实际农村污水的处理效果。将优势耐冷菌活化36 h,用无菌水调节各菌液的OD600为1.0,各菌株按表 1比例取不同体积菌液离心,收集菌体,将沉淀转入200 mL实际农村生活污水中,10 ℃下培养,定时摇动,每隔24 h测上层液COD值,实验重复3次,考察不同混菌体积配比对实际农村污水的处理效果。根据最优配比,将不同组成的菌体投加到含有载体的富集培养基中,在10 ℃、150 r/min的摇床中培养48 h,离心除上清,将沉淀在室温下真空干燥至恒重,然后分别称取2.0、3.0、4.0、5.0 g的菌剂,投加到装有200 mL实际农村生活污水的三角瓶中,在10 ℃下培养,每24 h测上层液COD,直至COD降至150 mg/L以下,观察不同菌剂投放量对COD的去除效果,实验重复3次,计算COD去除率。
从活性污泥中共分离纯化出62株耐冷菌。由于人工污水含营养成分比例较高,微生物在其中生长较快,因此,在10℃下利用人工污水可较为快速地考察分离出耐冷菌的COD降解效果。如表 2所示,相较而言,H-7、H-10、H-29、H-30、H-33、H-36、H-40、H-54这8株菌具有较好的COD降解效果,对人工污水的COD去除率均可达到40%以上,因此选择这8种耐冷菌作为优势菌种。
将这8株菌交由北京奥维森基因科技有限公司进行菌种的16S rDNA测序分析并对菌种进行鉴定,结果如表 3所示。一般来说,16S rDNA序列的同源性小于93%~95%时,可认为属于不同属;同源性小于98%时,可认为属于不同种。根据鉴定结果,8株菌与鉴定菌株的同源性均在99%以上,可以判断自主筛选的H-29、H-33、H-36菌株属于假单胞菌属,H-7、H-30、H-54属于土生拉乌尔菌属,H-10属于拉恩氏菌属,H-40属于液化沙雷菌属[12]。鉴定结果将有助于在相关种属中进一步筛选出有处理效果的低温微生物。
筛选出的8株菌在10 ℃下的生长曲线如图 1所示。接种12 h内,8株菌的OD值变化不大,处于延滞期。在12~48 h内,8株菌均进入对数生长期,OD值快速增大,其中H-29、H-36、H-7的OD值从0.1增至2.0以上,其余5株达到1.8左右。48 h后,8株菌处于静止期,其中H-33、H-36、H-10的OD值在96 h前后呈现出下降再升高的趋势,其余菌株的OD值则在96 h前后呈现出趋平再有所上升的趋势。培养120 h后,8株菌中假单胞菌属的H-29、H-33的OD值最高,分别达到2.1和2.2。与唐双[13]的研究结果相比,本文的假单胞菌在低接种量下延滞期较短,为12 h左右;对数生长期与文献相同,但稳定期较长,培养后期OD值最高至2.2左右,低于文献[13]的结果。由于接种量小,本文微生物生长曲线的OD值较低,但具有延滞期较短、稳定期较长的特点,有利于微生物快速适应新环境及进行污水处理时达到较好的出水水质。
根据农村生活污水的主要成分及厕改农户取样污水的COD值,设计模拟农村生活污水并利用实际农村污水进行降解性能实验。由于厕改粪水或农村生活污水在收集装置中缺乏加热及曝气,因此在实验中用定时摇晃静置培养模拟污水在实际装置中的处理情况;根据取样中测得的污水温度,培养温度确定为10 ℃。在吉林农村的厕改工程中,针对污水的收集处理目前采用原位收集处理的方式,考虑到北方农村居民大多拥有较大的土地面积,可利用土壤系统进一步实现污染物的分解及N、P元素在农村生态系统的循环,降低污水处理的难度、成本及能耗[14],因此采用我国农田灌溉水质标准(GB 5084—2005)作为处理指标[15]。8株菌在10 ℃和25 ℃下对模拟农村生活污水的COD去除效果如图 2、图 3所示,10 ℃下对实际农村生活污水的COD去除效果如图 4所示。
在对模拟农村生活污水的处理中,筛选出的8株耐冷菌均显示出较好的COD去除效果,模拟农村生活污水的COD在接种耐冷菌培养后都呈现出下降的趋势。10 ℃下培养第7天,菌株H-33首先将模拟农村生活污水的COD将至150 mg/L以下,为121.4 mg/L;第8天,8株菌均将污水的COD值降至150 mg/L以下,达到农田灌溉水质的标准。其中处理效果最好的前三株菌分别为H-33、H-29、H-40,其处理后的COD分别为90.62、105.4、132.2 mg/L。统计学差异分析结果显示第8天时H-33处理后的COD值与H-40相比极显著(P < 0.01)。培养至第9天,菌株H-30、H-33、H-29对模拟农村生活污水的处理效果最优,COD分别为82.20、88.02、89.53 mg/L,COD去除率分别为88.6%、87.8%和87.6%,出水COD可达到农田灌溉水标准中水作物的要求(ρCOD≤150 mg/L),同时满足对加工、烹饪及去皮蔬菜作物灌溉的COD要求(ρCOD≤100 mg/L)。模拟农村生活污水降解实验表明,H-29、H-30、H-33菌株在低温下有较高的降解能力,其中假单胞菌属的H-29、H-33所需的处理达标时间更短。
在相同处理条件下,将8株菌对模拟农村生活污水的处理温度提高到25 ℃,结果如图 3所示。在25 ℃下,8株菌处理后的模拟污水COD值基本上呈直线下降趋势,均在4 d内将模拟农村生活污水的COD降至150 mg/L以下,其中H-30、H-10和H-54的去除效果较好,出水COD分别为98.35、100.5、109.9 mg/L,COD去除率分别为86.5%、86.1%、84.8%。与10 ℃的处理效果相比,温度较高时土生拉乌尔菌属的菌株H-30、H-54和拉恩氏菌属的菌株H-10处理效果更优一些,特别是H-30在10 ℃和25 ℃中都表现出最优的处理效果,且处理效果接近。相比之下,温度提高有助于微生物更加迅速地降低污水中的COD。在10 ℃时,H-30将模拟农村生活污水的COD降至100 mg/L左右时需要9 d,而在25 ℃时则需要4 d,10 ℃低温处理所需达标时间约为25 ℃下的两倍。因此,在开发设计农村污水原位处理设备时,要保障污水在功能区域的停留时间满足低温菌的处理时间要求,以达到预期的处理效果。
8株耐冷菌对实际农村生活污水的处理效果如图 4所示。从图中可以看出,10 ℃下处理第8天,菌株H-7、H-33、H-29先将污水COD降至150 mg/L以下,处理后的COD分别为129.6、130.4、138.7 mg/L;第9天,8株菌处理的实际农村生活污水COD均降至150 mg/L以下。同样的是,菌株H-7、H-29、H-33的处理效果较好,出水COD分别为94.55、95.99、97.27 mg/L,COD去除率分别为83.2%、82.9%和82.7%,统计学差异分析结果显示H-29与H-33之间无显著性差异。培养至第10天,对实际农村污水处理效果最优的菌株是H-29、H-7、H-33,出水COD分别为81.21、82.47、83.36 mg/L,COD去除率分别为85.6%、85.4%、85.2%。与模拟农村生活污水的处理相比,实际农村生活污水中的优势菌有所区别,除了H-29、H-33,土生拉乌尔菌属的H-7代替H-30表现出了较好的处理效果。虽然实际农村生活污水的COD值较模拟农村生活污水的值低,但总体来说,处理达标时间较模拟农村生活污水的有所延长,说明实际农村生活污水的成分更为复杂,土著微生物的存在对不同菌株的处理效果产生了影响。根据菌株在不同污水中的降解情况,通过调整配比改变混合微生物组成,利用不同菌种的处理优势,将有可能使污水得到快速有效的降解。
通过降解性实验,发现假单胞菌属和土生拉乌尔菌属的菌株均表现出较好的降解效果,特别是假单胞菌广泛用于环境处理中。高新新等[16]从活性污泥中分离出一株高效降解废水中有机物的假单胞菌,该菌在4 ℃和25 ℃下对初始COD为800 mg/L的模拟生活污水去除率分别达71.2%和78.8%;姜安玺等[17]从污泥中分离得到在0~9 ℃下可降解生活污水中有机物的假单胞菌, 对初始COD为500 mg/L的模拟生活污水去除率最高为81.9%;而本文所筛选出的假单胞菌在10℃下对初始COD为700 mg/L左右的模拟农村生活污水去除率可达88.6%,可降解COD总量较大,去除率较高,具有良好的应用潜力。
2.4 混合耐冷菌及菌剂对实际农村污水的处理效果根据8株菌对模拟农村生活污水及实际农村生活污水的处理效果,将其按不同体积比进行混合,测定混合耐冷菌10 ℃下对实际污水处理7 d后的COD去除效果,结果如表 4所示。可以看出,配比5的COD去除率最高,可达到94.1%。该配比中,H-29、H-30、H-33所占的比例最高,同时采用这3株菌单独对模拟污水和实际污水处理时,在处理时间和处理效果上均表现出明显的处理优势。同样,这3株菌所占比例较高的配比3和配比6对实际农村生活污水的COD去除率都在92%以上;并且,混菌处理所需的时间和处理程度要好于单株菌处理,达到基本同等的处理效果,混菌处理需要7 d,而单菌株处理则需要10 d。
将所筛选出的8株耐冷菌按照配比5的比例混合后制备菌剂,以不同的投加量投加到200 mL实际农村生活污水中,COD的变化趋势如图 5所示。由图中可以看出,不同的菌剂投加量有类似的降解趋势,但随着菌剂投加量增大,实际污水的COD去除加快,投放4 g和5 g菌剂的污水COD在第7天已经降到150 mg/L以下;第8天,各个投放量的污水COD均达到农田灌溉水质标准,4 g投放量的污水COD去除率最高,达83.6%。此外,统计学差异分析结果显示,第8天时投放4 g菌剂的污水COD值显著低于2 g和3 g(P < 0.05),投放5 g菌剂的COD值同样显著低于2 g和3 g(P < 0.05),但4 g投放量与5 g投放量的去除率之间无显著性差异。说明菌剂投加量为4 g时处于饱和状态,更多的投加量不但造成菌剂的浪费,还可能由于初始微生物数量过多,出现污水前期处理COD下降较快,但后期污水营养成分不足的现象,导致微生物死亡,从而引起出水COD变高的现象。在常温下,鲁姗等[18]从污泥中分离多株高效降解菌,混合配比后对初始COD为663 mg/L的农村生活污水处理5 d,有机物降解率为84.46%,与本文在低温条件下将混菌制成菌剂的结果相近,表明本文筛选的低温微生物在低温污水处理上具备应用价值。
使用配比5的混合菌株对实际农村生活污水进行处理,COD去除率为94.1%,而制成菌剂后处理效果有所下降,去除率最高为83.6%,说明制备过程中菌体生长的不对称性、载体的性质、干燥手段等因素对混菌中各微生物的数量及活力造成了影响,但将微生物制备成菌剂将有利于微生物的保存、运输和使用,具有更广泛的使用范围。
3 结论(1) 从低温驯化的活性污泥中分离筛选出8株在10 ℃下仍具有较好COD去除效果的耐冷菌,经过生理生化和形态学测定以及16S rDNA基因测序比对分析,8株耐冷菌分别属于假单胞菌属、土生拉乌尔菌属、拉恩氏菌属和液化沙雷菌属。
(2) 在10 ℃条件下、单一菌株处理模拟农村生活污水的比较中,假单胞菌属的菌株H-33最快将污水处理至达到我国农田灌溉水质标准,所需时间为7 d,出水COD为121.4 mg/L;处理9 d,8株菌均可将污水处理至达标,其中拉恩氏菌属的菌株H-30对污水的COD去除率最高,为88.6%,出水COD最低,为82.20 mg/L。
(3) 在10 ℃条件下、利用单一菌株处理实际农村生活污水,土生拉乌尔菌属的菌株H-7、假单胞菌属的菌株H-33和H-29最快将污水处理至达到我国农田灌溉水质标准,所需时间均为8 d,出水COD分别为129.6、130.4、138.7 mg/L;第10天,8株菌均可将污水处理至达标,其中假单胞菌属的菌株H-29对污水的COD去除率最高,为85.6%,出水COD为81.2 mg/L。
(4) 将各耐冷菌株以不同体积比混合,其中H-7、H-10、H-29、H-30、H-33、H-36、H-40、H-54体积比为2:1:4:4:4:1:1:1的混合菌液在10℃下对实际农村生活污水的COD去除率最高,为94.1%;与单一菌处理相比,混菌处理COD去除率较高,处理达标时间也缩短至7 d;制成菌剂后8 d可将实际农村生活污水COD从562.7 mg/L降至91.32 mg/L,去除率为83.6%,达到我国农田灌溉水质标准。
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