超顺磁性Fe3O4粒子是一种安全性高、生物相容性好的介质材料，目前被广泛应用于酶的固定化、生化分离等[1-2]生物工程领域，以及免疫监测、核磁成像、抗菌、抗癌等[3-5]生物医学领域，此外，其在环保领域也有巨大的应用潜力[6-8]。
研究者们对铁基磁性粒子的合成方法进行了大量研究[9-12]，其中溶剂热法因反应条件简单、尺寸及形貌可控、结晶好、饱和磁化强度高，并且容易实现物化性能的改进而受到关注[11-12]。目前文献报道的溶剂热法大都是用静态反应釜合成超顺磁性Fe3O4粒子，因传热传质影响导致放大困难，所以大都使用100~200 mL的小容积反应釜，合成量低且成本高，难以满足实验和市场的需要。此外，出于DNA分子分离提取自动化和高通量快速提取的需要，对超顺磁Fe3O4@SiO2粒子的需求量日益增加，有关其制备及核酸提取等方面的研究仍在持续进行中[13-16]。
本文通过溶剂热法使用动态反应釜制备超顺磁性Fe3O4粒子，为动态反应放大奠定基础；将动态反应合成的Fe3O4粒子表面包覆SiO2，以获得具有良好分散性的Fe3O4@SiO2粒子用于质粒DNA的提取，并对其可重复利用性进行研究。
1 实验部分 1.1 实验原料和仪器 1.1.1 实验原料六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、醋酸钠(NaAc)、氯化钠(NaCl)、乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)、聚乙二醇(PEG)4000、PEG 8000、乙二醇、三羟甲基氨基甲烷(TriS)，国药集团化学试剂有限公司；NaOH、正硅酸乙酯(TEOS)、无水乙醇、乙酸钾(KAc)，25.0%~28.0%的氨水，北京化工厂；TritonX-100，≥90.0%，北京拜尔迪生物技术有限公司。以上试剂均为分析纯。
E. coli pUC-18为实验室保藏菌种，E. coli pUC-18-PT7-EGFP-TT7(1)为本校其他课题组提供；PCR上游引物序列为TTTGATTCGGTAATCTCCGAAC，下游序列为TTACCTCACTCATTAGGCACCC，生工生物(上海)股份有限公司；2×Taq PCR Mix，RNA酶A，北京拓英坊生物有限公司。
1.1.2 实验仪器LEO-1530型扫描电子显微镜(SEM)，英国Oxford公司；JEM-2100F型电子透射显微镜(TEM), 日本电子株式会社；7410型振动样品磁强计(VSM)，美国Lake Shore公司；3100型傅里叶红外光谱仪(FT-IR)，美国Varian公司；D/max-Ultima Ⅲ型X射线衍射仪(XRD)，日本Rigaku公司；BioDoc 2 ItTM紫外成像系统，英国UVP公司；K5500型微量分光光度计，北京奥凯科技发展有限公司。
1.2 试剂配制溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、TE缓冲液及PEG结合液的配制方法与文献[17]一致。
溶液Ⅰ 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、10 mmol/L EDTA (pH 8.0)、50 mmol/L葡萄糖，121 ℃下高压灭菌15 min，4 ℃保存备用。
溶液Ⅱ 使用前配制0.2 mol/L NaOH、1% SDS。
溶液Ⅲ 3 mol/L醋酸钾缓冲液(KAc，pH 5.2)，4 ℃保存备用。
TE缓冲液 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1 mmol/L EDTA(pH8.0)，121 ℃下高压湿热灭菌20 min，4 ℃保存备用。
PEG结合液 2 mol/L NaCl，20% PEG8000，4 ℃保存备用。
1.3 实验方法 1.3.1 超顺磁性Fe3O4粒子的制备称取一定量的FeCl3·6H2O置于乙二醇溶液中，搅拌直至完全溶解，再加入一定量的无水NaAc、PEG4000，常温下继续剧烈搅拌30 min，然后将混合液体转入动态反应釜中，在一定的搅拌速率和反应温度下连续反应8 h。将反应产物在磁场条件下进行分离，将得到的固体粉末分别用去离子水和无水甲醇反复洗涤3~5次，置于真空干燥箱中50 ℃干燥6 h，即可得到超顺磁性Fe3O4粒子。
1.3.2 Fe3O4@SiO2粒子的制备采用Stöber法制备Fe3O4@SiO2粒子[18]。称取Fe3O4粒子4.0 g，加入一定量的TEOS和8 mL Triton X-100超声分散2 min，再加入250 mL去离子水，超声分散20 min，转移至1 L圆底烧瓶，向其中加入100 mL氨水和250 mL无水乙醇，在室温条件下以一定速率搅拌反应4 h。停止搅拌，用去离子水和乙醇分别清洗数次，磁性分离，60 ℃真空干燥6 h，得到Fe3O4@SiO2复合粒子。
1.3.3 Fe3O4@SiO2磁性粒子提取质粒DNA将E. coli pUC-18接种于LB液体培养基，37 ℃培养过夜。摇匀培养基，吸取1.5 mL置于1.5 mL离心管中，以离心力10 600 g离心1 min, 收集菌体。加入预冷的250 μL溶液Ⅰ(含RNA酶A)，用微量移液器反复吸打，进行菌体重悬浮，室温条件下静置5 min；加入等体积的溶液Ⅱ，温和反复颠倒2~3次，混匀，静置5 min；再加入等体积溶液Ⅲ，温和反复颠倒2~3次混匀，10 600 g离心5 min，弃沉淀。取400 μL上清液至另一支离心管中，加入50 μL自制的Fe3O4@SiO2磁性粒子(溶液Ⅰ配制，100 mg/mL)悬液，再加入400 μL PEG结合液，混匀，静置5 min。磁性分离，用500 μL 70%乙醇洗涤磁性粒子2次，60 ℃烘箱中放置10 min挥去乙醇，用50 μL TE缓冲液(pH 8.0)洗脱。含DNA分子的TE缓冲液用于琼脂糖凝胶电泳。洗脱DNA后的Fe3O4@SiO2再次用于质粒DNA提取。
将E. coli pUC-18-PT7-EGFP-TT7(1)用上述同样方法进行质粒DNA提取，但质粒DNA吸附到Fe3O4@SiO2上后，一部分不经TE缓冲液洗脱(即Fe3O4@SiO2@DNA)直接用作聚合酶链式反应(PCR)扩增模板，另一部分用TE缓冲液洗脱后再次用于质粒DNA吸附。PCR扩增反应体系为ddH2O 23 μL、2×Taq PCR Mix 25 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL，混匀，用枪头沾取些许Fe3O4@SiO2@DNA加入上述反应体系中。置PCR仪上94 ℃预变性5 min后进入扩增循环阶段：94 ℃变性0.5 min、55 ℃退火3 min、72 ℃延伸1.5 min，循环33次；72 ℃保温7 min，4 ℃保存。
1.3.4 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳取6 μL提取质粒DNA溶液或PCR扩增产物与2 μL 6×上样缓冲液混匀，上样0.8%琼脂糖凝胶上样孔，100 V电泳50 min。取下凝胶，通过凝胶成像系统观察电泳结果。
2 结果与讨论 2.1 Fe3O4磁性粒子的制备与表征结果通过对反应底物FeCl3·6H2O的加入量、反应时间、反应温度、反应釜搅拌速率等条件优化，获得最佳的反应条件为：1.6 L乙二醇中FeCl3·6H2O、PEG4000、NaAc加入量分别为35 g、25 g、90 g，反应温度200 ℃，时间10 h，反应釜的搅拌速率450 r/min。通过SEM图(图 1(a)、(b))可知，得到的磁性粒子粒径约200 nm，并具有良好的分散性和均一性。该粒径小于本实验室用100 mL静态反应釜制备的超顺磁性Fe3O4粒子(粒径400 nm左右)[1]，制备量也从0.4~0.5 g提高到8~10 g，单次单釜制备量提高近20倍。
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图 1 Fe3O4粒子SEM图及其放大图 Fig.1 SEM and enlarged SEM images of Fe3O4 particles |
通过XRD对Fe3O4粒子进行表征的结果如图 2所示。可以看出，谱图中出现220、311、400、422、511及440晶面峰，无其他杂峰，结晶良好，为反尖晶石结构，与Fe3O4标准卡片(JCPDS 79-4019)一致，也与本课题组通过静态反应釜合成的Fe3O4粒子晶体结构相同[1]。
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图 2 Fe3O4粒子XRD图 Fig.2 XRD pattern of Fe3O4 particles |
图 3为VSM测试得到的Fe3O4粒子磁化曲线。可以看出，Fe3O4粒子的饱和磁化强度达到86 emu/g，具有较小的矫顽力(44.4 G)和剩磁(12.8 emu/g)。说明合成的Fe3O4粒子磁响应性能良好，并具有超顺磁性，即在无磁场条件下粒子可分散在反应体系中，在有磁场条件下可以方便地从分散体系中分离。
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图 3 Fe3O4粒子磁化曲线 Fig.3 Magnetization curves of Fe3O4 particles |
以TEOS为原料通过聚合反应生成SiO2，形成的Fe3O4@SiO2容易团聚，影响其分散性。本文实验表明将搅拌速率提高到600 r/min，可获得到具有核壳结构、分散性良好的Fe3O4@SiO2粒子(图 4(a)、(b))，SiO2壳层厚度约为20 nm(图 4(c))。
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图 4 Fe3O4@SiO2的SEM图及其放大图与TEM图 Fig.4 SEM, enlarged SEM and TEM images of Fe3O4@SiO2 particles |
图 5为Fe3O4和Fe3O4@SiO2的FT-IR谱图，其中590 cm-1左右为Fe3O4中Fe—O键的吸收峰，3 400 cm-1和1 600 cm-1处附近分别为O—H键的伸缩振动峰和弯曲振动峰；而1 100 cm-1附近为Si—O键的吸收峰，进一步说明SiO2包覆在Fe3O4表面[14-15]。
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图 5 Fe3O4和Fe3O4@SiO2的FT-IR谱图 Fig.5 FT-IR spectra of Fe3O4 and Fe3O4@SiO2 |
将Fe3O4@SiO2粒子作为介质进行质粒DNA提取分离。吸附了质粒DNA的Fe3O4@SiO2粒子用TE缓冲液洗脱后，再次用于质粒DNA的提取，共使用9个批次，将得到的质粒DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图 6。
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M—DNA Marker; 1~9—不同提取批次；10—商品试剂盒。 图 6 Fe3O4@SiO2分离提取质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图 Fig.6 Agarose gel electrophoresis of plasmid DNA isolated using Fe3O4@SiO2 |
由图 6可知，Fe3O4@SiO2可反复用于E. coli质粒DNA提取，但随着使用批次的增加，对应条带变暗，提取量有下降的趋势。对各批次进行DNA浓度测定(表 1)，可以看出随着提取批次增加，DNA提取量降低，与电泳结果一致。但各批次提取浓度均在100 ng/mL以上，并且各个批次的A260/A280值大都接近或高于1.8，说明所提取的质粒DNA无蛋白质污染，提取效果较好。由此可以表明，Fe3O4@SiO2对于DNA提取分离具有较好的可重复利用性，此结果在其他文献中尚未见有报道。
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下载CSV 表 1 Fe3O4@SiO2提取各批次质粒DNA的浓度及A260/A280值 Table 1 The concentration and A260/A280 of plasmid DNA in different batches of Fe3O4@SiO2 |
研究发现，质粒DNA不经洗脱吸附在Fe3O4@SiO2上作模板, 即将Fe3O4@SiO2@DNA直接加至PCR反应体系中进行PCR扩增，重复吸附9个批次均获得相同的DNA条带，并与预期设计结果一致(图 7)。该结果说明Fe3O4@SiO2对PCR扩增无抑制作用，Fe3O4@SiO2@DNA上的DNA无需洗脱分离，可直接作为PCR扩增模板，从而减少了DNA分离提取步骤。
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M—DNA Marker；1~9— Fe3O4@SiO2@DNA；10—Fe3O4@SiO2。 图 7 质粒DNA吸附到Fe3O4@SiO2为模板PCR产物电泳图 Fig.7 PCR electropherogram of Fe3O4@SiO2@DNA |
通过底物添加量、搅拌桨搅拌速率、温度等条件的优化，用动态反应釜放大获得粒径均一、单分散的超顺磁性Fe3O4粒子，制备量达8~10 g，为Fe3O4的放大制备奠定了基础。对获得的Fe3O4粒子进行SiO2修饰，制备出分散性良好的Fe3O4@SiO2磁性粒子并用于质粒DNA提取，发现Fe3O4@SiO2提取DNA具有良好的可重复利用性，降低了使用成本；DNA可与分离介质Fe3O4@SiO2一起加至PCR扩增反应体系作模板，实现正常的PCR反应。
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