聚乙烯醇(PVA)广泛用于纺织、造纸和涂料等行业，纺织工业产生的退浆废水残留大量PVA，造成严重的环境污染。相比于高温碱法，采用PVA生物降解法进行退浆，一方面有利于减少废物排放，另一方面有利于保护织物组织[1-2]。目前报道的PVA生物降解方式主要有两种：一种是PVA氧化酶(SAO)与氧化型PVA水解酶(OPH)组合降解，另一种是PVA脱氢酶(PVADH)与OPH组合降解[3-4]。
目前，已有Pseudomonas sp. VM15C和Sphingopyxis sp. 113P3两个菌株的pvadh基因得到确认[5-6]，后者在大肠杆菌和毕赤酵母中表达后酶活分别达到194 U/mL[7]和8 464 U/mL[8]，但是在大肠杆菌中易形成包涵体，需进行复杂的包涵体溶解和蛋白复性，而近一半蛋白无法恢复活性[7]；在毕赤酵母中则会因为体内蛋白酶的作用发生血红素结构域的切割，无法得到完整的PVADH[8]。成熟的PVADH位于周质空间，属于吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)依赖性醌酶，而大肠杆菌和毕赤酵母中生产的PVADH不含辅酶，需要结合其他菌株或人为提供的PQQ才具有催化活性。由于PQQ价格昂贵，增加了PVADH使用的成本，限制了其工业化应用。
作为一种热点工业微生物[9]，肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)具有如下优势：(1)含有pqqABCDEF基因簇(简称pqq)，能够天然生产辅酶PQQ[10]，节省外源添加PQQ的成本[11]；(2)作为原核宿主菌，在生产过程中发生蛋白酶切割PVADH的可能性小；(3)发酵成本低，生长快，能高效利用甘油生产1, 3-丙二醇、3-羟基丙酸等大宗化学品[12-13]，附加产值高。本文拟采用K. pneumoniae作为PVADH的生产菌株，实现PQQ-PVADH全酶的高效生物合成。
1 实验部分 1.1 材料 1.1.1 菌株与载体K. pneumoniae DSM2026，大肠杆菌E. coli DH5α，表达载体pET-3tac(将pET-28a的T7启动子替换为3个串联的tac启动子)，pET-15A-cm(将pET-28a的复制子替换为15A，抗性基因替换为氯霉素(cm)抗性基因)，均为本实验室保存。
1.1.2 培养基LB培养基：蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；NaCl 10 g/L；pH 7.0。固体培养基添加15 g/L琼脂。
甘油发酵培养基：甘油30 g/L，酵母粉3 g/L，KH2PO41.3 g/L，K2HPO4·3H2O 3.4 g/L，(NH4)2SO4 4.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCO3 0.1 g/L，微量元素1.25 mL/L[14]。
抗性培养基中加入50 μg/mL硫酸卡那霉素(kan)或17 μg/mL cm。
1.1.3 主要试剂限制性内切酶和DNA连接酶购买自NEB(北京)有限公司；Taq DNA聚合酶、质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒和DNA marker购买自北京博迈德基因技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购买自北京全式金生物技术有限公司；引物和优化后的pvadh由华大基因(北京)合成。DNA测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。其余常规化学试剂均为国产分析纯。
1.2 方法 1.2.1 重组菌构建以National Center for Biotechnology Information(NCBI)报道的Sphingopyxis sp. 113P3 pvadh基因序列(GenBank accession No. JQ235753)为模板，使用DNAMAN软件按照K. pneumoniae密码子偏好性优化，并添加EcoR I和Xho I两个酶切位点。将优化后的pvadh与pET-3tac质粒双酶切，经T4连接酶催化连接后，得到重组质粒pET-3tac-pvadh。
待重组质粒转化感受态E. coli DH5α经抗性筛选、菌落PCR验证和测序确认后，将正确的质粒电转至感受态K. pneumoniae DSM2026，得到重组菌Kp(pET-3tac-pvadh)。
为了解决超表达PVADH后PQQ供应不足的问题，构建另一个超表达PQQ的载体。根据GenBank报道的pqq基因序列设计引物，两端引入EcoR I和Hind III酶切位点(表 1)，克隆K. pneumoniae的pqq基因簇，PCR反应参数：94 ℃，5 min；94 ℃，40 s；55 ℃，40 s；72 ℃，6 min，30个循环；72 ℃，10 min，16 ℃保存。将PCR产物和质粒pET-15A-cm通过EcoR I和Hind III双酶切，经T4连接酶催化连接后，得到重组质粒pET-15A-cm-pqq，将其转化至E. coli DH5α感受态，抗性筛选得到的单菌落采用pET载体通用上游引物pET-up和pqqB基因下游引物pqqB-R进行菌落PCR验证，经测序确认后，将pET-15A-cm-pqq电转至Kp(pET-3tac-pvadh)中，得到同时超表达pvadh和pqq的双质粒菌株Kp(pvadh+pqq)，在含50 μg/mL kan和17 μg/mL cm的LB双抗固体培养基上培养，通过菌落PCR筛选同时含有两个质粒的单菌落。
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下载CSV 表 1 引物序列 Table 1 Primers used in this study |
菌株活化培养 在含4 mL LB培养基的试管中，按1%接种量(体积分数)加入保存的菌液，37 ℃，200 r/min，恒温震荡培养12 h。
摇瓶发酵培养 在含100 mL发酵培养基的250 mL三角摇瓶中，按1%接种量(体积分数)加入活化后菌液，37 ℃，200 r/min，微氧发酵。接种2 h后，加入0.5 mmol/L(异丙基硫代半乳糖苷)到发酵液中。
数据采集 每3 h取样，测定菌液在600 nm波长处的吸光值A600，24 h后取菌液制备粗酶液，测PVADH酶活。
发酵优化 通过单因素试验依次对甘油添加量、IPTG添加量、IPTG添加时间、发酵温度进行优化。
1.2.3 PVADH粗酶液制备和优化PVADH前体含由25个氨基酸组成的信号肽，在帮助PVADH跨膜之后被切除。成熟的PVADH属于周质蛋白，获得周质蛋白的方法有超声破碎法和渗透休克法[15]。本文对比了两种方法的效果。
(1) 超声破碎法获得PVADH粗酶液摇瓶发酵24 h后，取500 mL发酵液于4 ℃ 12 000 r/min下离心10 min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤1次后重悬于含1 mmol/L蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)的50 mL PBS缓冲液中。取25 mL重悬液置于50 mL离心管中，冰浴30 min，在冰水保护下进行间歇式超声处理，超声15 s，暂停45 s，反复10次左右，直至菌液变为澄清均质溶液。
(2) 渗透休克法获得PVADH粗酶液500 mL发酵液，离心去上清液，菌体用PBS缓冲液洗涤1次后重悬于50 mL 30%蔗糖溶液中，室温放置10 min，4 ℃离心收集菌体，再重悬于50 mL预冷的5 mmol/L MgSO4溶液中(含1 mmol/L PMSF)，吸打混匀后置于冰上20 min，4 ℃离心，得上清液，即周质蛋白溶液。
1.2.4 PVADH酶活性检测参考文献[16]中的方法对PVADH的酶活性进行检测，PVADH酶活定义为酶活检测体系中，每min减少1 nmoL 2, 6-二氯酚靛酚钠(DCIP)(ε=1.91×104 mmol/(L·cm))所需要的酶量为一个活力单位，单位U/mL。
2 结果与讨论 2.1 pvadh密码子的优化及其在K. pneumoniae中的异源表达不同物种对同义密码子的使用具有偏好，利用这一特点，有针对性地进行密码子优化，可帮助外源蛋白高效表达。为此，将Sphingopyxis sp. 113P3的pvadh序列根据K. pneumoniae的密码子偏好性进行优化，优化后的pvadh密码子适应指数(CAI)从0.7提升到0.95，理论上有利于提高蛋白的合成速率和数量。
提取pET-3tac质粒(图 1(a))，与合成的pvadh经EcoR I和Xho I双酶切并连接后，转入E. coli DH5α感受态。菌落PCR采用pET载体的通用引物pET-up与pvadh的下游引物pvadh-XhoI-R，图 1(b)中3号菌株为阳性重组菌。经测序确认后，将质粒pET-3tac-pvadh电转至K. pneumoniae感受态中，经菌落PCR确认(图 1(c))，即得到重组菌Kp(pET-3tac-pvadh)。
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图 1 重组菌株Kp(pET-3tac-pvadh)的构建 Fig.1 Construction of the recombinant strain Kp(pET-3tac-pvadh) |
发酵培养Kp(pET-3tac-pvadh)，15 h取样作SDS-PAGE蛋白电泳。如图 2所示，重组菌在67 kDa的位置出现特异性条带，符合切除信号肽之后PVADH蛋白的大小，说明实验成功实现了PVADH在K. pneumoniae中的异源表达。
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M—Marker; 1—K. pneumoniae wild-type (wt); 2—Kp(pET-3tac); 3—Kp(pET-3tac-pvadh)。 图 2 超表达pavdh肺炎克雷伯重组菌的SDS-PAGE蛋白电泳结果 Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant K. pneumoniae strain overexpressing pavdh |
将渗透休克法和超声破碎法分离PVADH蛋白的效果进行比较(表 2)，可以看出，渗透休克法获得粗酶液的总蛋白和酶活都不如超声法，但是因为渗透休克法获得的上清液中主要是周质蛋白，PVADH比活是超声破碎法得到的粗酶液的3.7倍，所以后续选择渗透休克法制备PVADH粗酶液。
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下载CSV 表 2 渗透休克法和超声破碎法获得PVADH粗酶液的效果比较 Table 2 Characteristics of the PVADH crude enzyme obtained by osmotic shock and ultrasonic fragmentation |
摇瓶发酵Kp(pET-3tac-pvadh)，24 h的PVADH酶活为45.47 U/mL(图 3)。前人在K. pneumoniae中超表达可溶性葡萄糖脱氢酶(sGDH)后发现辅酶PQQ不能满足sGDH的需求，额外添加PQQ能明显提升酶活[12]。
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图 3 添加或不添加PQQ时PVADH的酶活 Fig.3 PVADH activity with or without PQQ addition |
本文实验也发现，添加6 μmol/L的PQQ有助于提高Kp(pET-3tac-pvadh)酶活，相比不添加PQQ的粗酶液，添加PQQ的粗酶液酶活提高了55.6%(69.6 U/mL)，这说明超表达pvadh之后，辅酶PQQ的供给相对不足，所以考虑通过辅酶再生提高Kp(pET-3tac-pvadh)中PQQ产量。为了避免相同复制子在同一宿主中发生质粒不相容问题，采用了本实验室构建的pET-15A-cm载体超表达pqq。提取K. pneumoniae基因组(图 4(a))，克隆pqq(图 4(b))，通过EcoR I和Hind III位点插入pET-15A-cm，获得pET-15A-cm-pqq质粒，将其电转入Kp(pET-3tac-pvadh)感受态中，通过两组菌落PCR分别验证两个质粒的存在：①采用通用上游引物pET-up和pqqB-R验证pET-15A-cm-pqq质粒，正确条带大小为1 500 bp(图 4(c))；②采用pET-up与pvadh-xhoI-R验证pET-3tac-pvadh质粒，正确条带大小为2 300 bp(图 4(d))。包含两个质粒的菌株即为Kp(pvadh+pqq)。
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图 4 同时超表达pvadh和pqq的K. pneumoniae重组菌构建 Fig.4 Construction of recombinant K. pneumoniae strain coexpressing genes pvadh and pqq |
在摇瓶发酵培养阶段，与野生型K. pneumoniae及Kp(pET-3tac-pvadh)相比，Kp(pvadh+pqq)在开始时显示出明显的生长负荷，但随着时间的延长其生长速度加快，9 h后生物量接近野生型和Kp(pET-3tac-pvadh)(图 5(a))。24 h时检测酶活，发现Kp(pvadh+pqq)的PVADH酶活明显提高，在没有添加PQQ的情况下酶活达到了67.5 U/mL(图 5(b))。以上结果说明辅酶再生很好地满足了PVADH对PQQ的需求。
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图 5 Kp(pET-3tac-pvadh)和Kp(pvadh+pqq)的生长情况与PVADH酶活 Fig.5 Growth and PVADH activities of Kp(pvadh+pqq) and Kp(pET-3tac-pvadh) |
为进一步提高K. pneumoniae中PQQ-PVADH产量，对Kp(pvadh+pqq)的发酵体系进行单因素优化，具体参数包括甘油浓度、IPTG添加量和添加时间及温度。
首先是甘油浓度的优化。K. pneumoniae能高效代谢甘油[13]，因此选择甘油作为Kp(pvadh+pqq)的碳源。实验对比了不同甘油浓度对菌体生长和PVADH酶活的影响，结果如图 6所示，发现随着甘油质量浓度从10 g/L升至40 g/L，Kp(pvadh+pqq)的生长量持续攀升，PVADH酶活也随着生物量一同升高；但当甘油质量浓度超过40 g/L后，Kp(pvadh+pqq)的生长量和PVADH酶活不升反降，推测可能是高浓度甘油增加了培养基黏度，影响了菌体生长。
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图 6 Kp(pvadh+pqq)发酵中甘油浓度的优化 Fig.6 Optimization of glycerol concentration in fermentation of Kp(pvadh+pqq) |
然后是IPTG添加量的优化。构建的两个质粒分别超表达pvadh和pqq，都需要IPTG诱导表达，适度增加IPTG浓度有助于提升两个基因的表达量。从图 7可知，随着IPTG添加量的升高，菌体生物量持续下降，表明IPTG对菌体生长有明显抑制作用；但PVADH的酶活却有明显提升，说明IPTG诱导对pvadh和pqq的高效表达至关重要，结果显示加入0.6 mmol/L IPTG时PVADH酶活最高。
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图 7 Kp(pvadh+pqq)发酵中IPTG添加量的优化 Fig.7 Optimization of IPTG addition in Kp(pvadh+pqq) fermentation |
之后是诱导剂添加时间的优化。如图 8所示，接种后1 h到3 h，Kp(pvadh+pqq)的生物量A600从0.11缓慢提升到0.67，在A600=0.1~0.4区间内，生物量越大，添加IPTG对24 h后PVADH酶活的提升效果越明显，但当A600达到0.67时添加IPTG，PVADH酶活明显降低，所以选择发酵后2.5 h(A600=0.4)添加IPTG。
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图 8 Kp(pvadh+pqq)发酵中IPTG添加时间的优化 Fig.8 Optimization of time to add IPTG in Kp(pvadh+pqq) fermentation |
最后是发酵温度的优化。如图 9所示，随着温度从25 ℃升高到37 ℃，Kp(pvadh+pqq)的生物量和PVADH酶活均有明显提高；但当温度升至42 ℃后，菌体生长严重受阻，生长量和PVADH酶活骤降，所以选择37 ℃作为Kp(pvadh+pqq)的发酵温度。
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图 9 Kp(pvadh+pqq)发酵温度的优化 Fig.9 Optimization of temperature in Kp(pvadh+pqq) fermentation |
综合以上结果，优化后的条件为：40 g/L甘油，37 ℃，2.5 h后添加0.6 mmol/L IPTG进行发酵，24 h时PVADH酶活可达到80.7 U/mL。
3 结论成功在PQQ天然生产菌K. pneumoniae中异源表达了pvadh，通过密码子优化实现了PVADH的高效表达，PVADH酶活达到45.47 U/mL；为解决PQQ供应不足的问题，构建双质粒表达系统同时超表达pqq基因簇，提高宿主菌的PQQ合成量，进一步补充了辅酶PQQ，PVADH酶活达到67.5 U/mL；最后通过发酵条件优化，PVADH酶活达到80.7 U/mL。
目前K. pneumoniae尚未通过基因工程优化其基因组，不具备商业化底盘微生物如E. coli和P. pastoris在基因表达方面的优势，因此其PVADH产量相对较低。但作为一种PQQ天然生产菌，K. pneumoniae在生产PVADH的同时节省了添加辅酶PQQ的高昂成本，为PQQ-PVADH的生产提供了另一个选择方案。随着K. pneumoniae表达体系的不断优化，PQQ-PVADH产量还将进一步提升。
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