辣椒素是辣椒果实中所含的一类生物碱，是辣椒辛辣味的主要来源和具有药理作用的主要成分[1], 它主要由辣椒碱单体(约占68%)、二氢辣椒碱(约占25%)和降二氢辣椒碱(约占5%)组成[2]。有学者研究表明，高纯度辣椒碱单体具有戒毒镇痛[3-5]、抗氧化[6]、消炎止痒[7]等多种药理作用，因此广泛应用于医药、生化农药、饮食保健、军事和化工等领域[8]。
关于辣椒素的抑菌作用已有文献报道，Jones等[9]发现辣椒素能抑制胃病原菌—幽门螺旋杆菌；郭丽等[10]的研究表明辣椒素能抑制3种常见的病原细菌—金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，及啤酒酵母、黑曲霉等病原真菌，并提出辣椒素可有效抑制番茄中微生物的生长代谢；杨海燕等[11]发现，辣椒素能抑制食品中的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、澳大利亚酵母、啤酒酵母等，但对霉菌无抑制效果；魏玉西等[12]对辣椒素的抑菌特性进行了研究，结果表明辣椒素对细菌有着广泛的抑菌谱，但对霉菌的抑制作用较弱；康雅[13]也对辣椒素的抑菌活性进行分析，得出类似的结论，并研究了pH、温度等影响抑菌特性的因素。但以上试验报道所采用的辣椒素样品都是含有多种辣椒碱类似物成分的复合物，具体到每种单体的抑菌效果尚需进一步探索。
本文采用辣椒素主要成分—高纯度辣椒碱单体、二氢辣椒碱单体、降二氢辣椒碱单体与辣椒素共同进行抑菌试验，考察辣椒碱单体、二氢辣椒碱单体和降二氢辣椒碱单体的抑菌效果，并分别与辣椒素的抑菌效果进行比较，为开发更为高效的天然抑菌防腐剂奠定基础。
1 试验部分 1.1 试验原料和仪器辣椒素、辣椒碱单体、二氢辣椒碱单体和降二氢辣椒碱单体均由本实验室分离纯化得到[14]，其中辣椒素纯度99.1%(包括辣椒碱单体61.6%，二氢辣椒碱32.3%，降二氢辣椒碱5.2%)，辣椒碱单体纯度98.0%，二氢辣椒碱纯度97.5%，降二氢辣椒碱单体纯度97.3%。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，CMCC(B)26003)，大肠杆菌(Escherichia coli，CMCC(B)44102)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，CMCC(B)10104)，白色念珠菌(Monilia albican，CMCC(F)98001)，黑曲霉菌(Aspergillus niger，CMCC(F)98003)，均购自广东环凯微生物科技有限公司。
胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)，胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA)，沙氏葡萄糖液体培养基(SDB)，沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)，均为北京奥博星生物技术有限责任公司生产, 压力蒸汽灭菌后备用。
AR522CN型电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；LDZX-50KBS型立体高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；HZQ-F型恒温振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；YT-CJ-1D型超净工作台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；SPX-250BⅢ型生化培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；LC-15C型高效液相色谱仪，日本岛津。
1.2 试验方法 1.2.1 试样的制备将辣椒素配置成质量浓度为0.2mg/mL的乙酸乙酯储备液[15]，再用乙酸乙酯依次稀释制至0.1、0.05、0.025、0.0125mg/mL的浓度梯度。辣椒碱单体、二氢辣椒碱单体和降二氢辣椒碱单体试样的制备同上。
1.2.2 菌悬液的制备取活化好的供试菌种，用接种环挑取少量的细菌、黑曲霉菌孢子和白色念珠菌体，采用无菌生理盐水梯度稀释，分别制成菌体和孢子悬浮液。细菌浓度控制在1×109~2×109mL-1，黑曲霉菌孢子浓度控制在1×108~8×108mL-1，白色念珠菌浓度控制在1×108~7×108mL-1。
1.2.3 辣椒碱抑菌特性测定采用滤纸片法进行抑菌特性的测定。用打孔器将定性滤纸打成直径7mm的小圆片，经压力蒸汽灭菌处理后，放置于120℃烘箱中烘干2h保存备用；将灭菌后的滤纸片分别浸入辣椒素、辣椒碱单体、二氢辣椒碱单体、降二氢辣椒碱单体的乙酸乙酯和食品防腐剂苯甲酸钠溶液(0.06mg/mL)中[11]浸泡24h；在无菌操作条件下分别取100μL 1.2.2节制备的各菌悬液加入到已制备好的培养基平板中涂布均匀，然后用无菌镊子将浸好的滤纸片紧贴于平板表面，并以浸有乙酸乙酯的滤纸片作对照；细菌置于37℃恒温培养箱中培养18~24h，真菌在23℃下培养24~48h，观察结果。用游标卡尺测量抑菌圈的直径，每组试验重复5次。
2 结果与讨论 2.1 辣椒素的抑菌特性通过对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉菌进行辣椒素抑菌试验，得到结果如表 1所示。由表 1可知，辣椒素对试验所用细菌、白色念珠菌均有抑制作用，但对黑曲霉菌无抑制作用。在3种供试细菌中，辣椒素对S. aureus的抑制作用最强，而对E. coli和P. aeruginosa的抑制作用相对较小；当辣椒素质量浓度大于0.025mg/mL时，在3种供试菌中均可观察到明显的抑菌圈。另外从表 1还可以发现，辣椒素对真菌的抑菌作用相对较弱，当质量浓度低于0.025mg/mL时, 辣椒素对M. albican和A. niger基本无抑菌活性。由此可见，辣椒素对各种菌株抑菌作用大小依次为S. aureus>E. coli>P. aeruginosa>M. albican>A. niger。从表 1还可以看出，0.2mg/mL的辣椒素抑菌效果优于0.06mg/mL的苯甲酸钠。
|
下载CSV 表 1 不同浓度辣椒素对不同受试菌抑菌效果的影响 Table 1 Effect of inhibition of different concentrations of capsaicinoids on different microbes |
辣椒碱单体是一种含酚羟基的生物碱，为辣椒中引起辛辣味的主要化学物质，是辣椒素中含量最高的组分，约占辣椒素总含量的68%。通过对S. aureus、E. coli、P. aeruginosa、M. albican、A. niger的辣椒碱单体抑菌试验结果(表 2)分析可知，辣椒碱单体对试验所用细菌和真菌的抑制作用与辣椒素类似，但比辣椒素抑菌效果更佳，且在其质量浓度为0.1mg/mL时抑菌效果就明显好于质量浓度为0.06mg/mL的苯甲酸钠。当质量浓度在0.025mg/mL以上时，辣椒碱单体对供试细菌、白色念珠菌均有较强的抑制作用，抑菌圈直径都大于8.5mm。在大于0.0125mg/mL的试验浓度范围均可观察到明显的抑菌圈，因此，辣椒碱单体比辣椒素的抑菌性能更强。
|
|
下载CSV 表 2 不同浓度辣椒碱单体对不同受试菌抑菌圈直径的影响 Table 2 Effect of different concentrations of capsaicin monomer on the diameter of the inhibition zone of different microbes |
二氢辣椒碱单体与辣椒碱单体的结构非常相似，两者只是在碳链第六位上存在单双键的差别。为了考察二氢辣椒碱单体的抑菌效果，对其进行抑菌试验。由试验结果(表 3)可知，二氢辣椒碱单体对试验所用细菌和真菌的抑制作用与辣椒素和辣椒碱单体类似，抑菌效果和辣椒素相近，较辣椒碱单体的抑菌效果要弱。当质量浓度低于0.025mg/mL时，二氢辣椒碱单体的抑菌效果不明显。
|
|
下载CSV 表 3 不同浓度二氢辣椒碱单体对不同受试菌抑菌圈直径的影响 Table 3 Effect of different concentrations of dihydrocapsaicin monomer on the diameter of the inhibition zone of different microbes |
降二氢辣椒碱占辣椒素的5%左右，是辣椒素的第三大组成成分。降二氢辣椒碱单体的抑菌试验结果(表 4)表明，降二氢辣椒碱单体对试验所用细菌、真菌的抑制作用规律与辣椒素、辣椒碱单体以及二氢辣椒碱单体相同，抑菌效果与二氢辣椒碱单体相近，比辣椒素以及辣椒碱单体要差。当质量浓度低于0.025mg/mL时，降二氢辣椒碱的抑菌效果不明显。
|
|
下载CSV 表 4 不同浓度降二氢辣椒碱单体对不同受试菌抑菌圈直径的影响 Table 4 Effect of different concentrations of nordihydrocapsaicin monomer on the diameter of inhibition |
通过比较各个单体在质量浓度0.2mg/mL时的抑菌效果(图 1)，发现辣椒碱单体、二氢辣椒碱单体、降二氢辣椒碱单体和辣椒素的抑菌规律基本一致，对各种菌株抑制作用大小依次为S. aureus>E. coli>P. aeruginosa>M. albican；其中辣椒碱单体的抑菌效果明显好于二氢辣椒碱单体、降二氢辣椒碱单体和辣椒素，而后三者的抑菌效果相差不大。通过比较，各单体和辣椒素对S. aureus的抑菌效果由大到小依次为辣椒碱单体＞二氢辣椒碱单体＞辣椒素＞降二氢辣椒碱单体，对E. coli的抑菌效果由大到小依次为辣椒碱单体＞二氢辣椒碱单体=辣椒素＞降二氢辣椒碱单体，对P. aeruginosa的抑菌效果由大到小依次为辣椒碱单体＞辣椒素＞二氢辣椒碱单体＞降二氢辣椒碱单体，对M. albican的抑菌效果由大到小依次为辣椒碱单体＞辣椒素=降二氢辣椒碱单体＞二氢辣椒碱单体。采用F检验法分析，结果表明各单体和辣椒素对S. aureus和P. aeruginosa的抑制效果存在显著性差异(P < 0.05)，而对E. coli和M. albican的抑制效果没有显著性差异。
|
图 1 辣椒素和各单体对不同微生物的抑菌效果比较 Fig.1 Effect comparison of capsaicinoid and each monomer on the diameter of the inhibition zone of different microbes |
采用滤纸片法的抑菌试验结果表明，辣椒碱单体、二氢辣椒碱单体、降二氢辣椒碱单体和辣椒素均对细菌有较好的抑菌活性，而对真菌的抑菌活性较弱；它们对5种菌株的抑菌作用依次为S. aureus>E. coli>P. aeruginosa>M. albican>A. niger。通过比较辣椒素及其各单体的抑菌效果发现，辣椒碱单体的抑菌效果明显优于辣椒素及其他两种单体，而辣椒素、二氢辣椒碱单体和降二氢辣椒碱单体的抑菌效果基本一致。因此，以辣椒碱单体为主要原料开发天然高效的广谱抑菌材料和食品抑菌防腐剂具有重要的实际意义。
| [1] |
景作亮, 邓启良, 杨南, 等. 辣椒碱的研究进展及应用[J]. 天津化工, 2004, 18(6): 9-11. JING Z L, DENG Q L, YANG N, et al. Research progress and application of capsaicin[J]. Tianjin Chemical Industry, 2004, 18(6): 9-11. (in Chinese) DOI:10.3969/j.issn.1008-1267.2004.06.003 |
| [2] |
刘可春, 宋广运, 刘昌衡, 等. 辣椒碱的分离纯化及分析[J]. 山东科学, 2000, 13(1): 25-28. LIU K C, SONG G Y, LIU C H, et al. Separation, purification and analysis of capsaicin[J]. Shandong Science, 2000, 13(1): 25-28. (in Chinese) |
| [3] |
FOSTER D C, DWORKIN R H, WOOD R W. Effects of intradermal foot and forearm capsaicin injections in normal and vulvodynia-afflicted women[J]. Pain, 2005, 117(1/2): 128-136. |
| [4] |
MASON L, MOORE R A, DERRY S, et al. Systematic review of topical capsaicin for the treatment of chronic pain[J]. BMJ, 2004, 328: 991. DOI:10.1136/bmj.38042.506748.EE |
| [5] |
WINOCUR E, GAVISH A, HALACHMI M, et al. Topical application of capsaicin for the treatment of localized pain in the temporomandibular joint area[J]. Journal of Orofacial Pain, 2000, 14(1): 31-36. |
| [6] |
李宗友. 辣椒辣素对不同刺激剂诱导的脂质过氧化的调节作用[J]. 国外医学(中医中药分册), 1994, 16(3): 10-12. LI Z Y. Regulation of capsaicin on lipid peroxidation induced by different stimulators[J]. Foreign Medical Sciences, 1994, 16(3): 10-12. (in Chinese) |
| [7] |
CRUWYS S C, GARRETT N E, KIDD B L. Sensory denervation with capsaicin attenuates inflammation and nociception in arthritic rats[J]. Neuroscience Letters, 1995, 193(3): 205-207. DOI:10.1016/0304-3940(95)11704-Z |
| [8] |
王东, 丁雪艳. 辣椒碱的生产和应用[J]. 精细化工原料及中间体, 2005(12): 19-21. WANG D, DING X Y. Production and application of capsaicin[J]. Fine Chemical Industrial Raw Materials & Intermediates, 2005(12): 19-21. (in Chinese) |
| [9] |
JONES N L, SHABIB S, SHERMAN P M. Capsaicin as an inhibitor of the growth of the gastric pathogen Helicobacter pylori[J]. FEMS Microbiology Letters, 1997, 146(2): 223-227. DOI:10.1111/j.1574-6968.1997.tb10197.x |
| [10] |
郭丽, 王巧珍, 朱林. 辣椒碱抗病原菌活性及其在番茄酱防腐中的应用[J]. 合肥工业大学学报(自然科学版), 2006, 29(1): 117-121. GUO L, WANG Q Z, ZHU L. Study on the anti-pathogenic activities of capsaicin and effects of its antiseptic application to ketchup[J]. Journal of Hefei University of Technology(Natural Science), 2006, 29(1): 117-121. (in Chinese) |
| [11] |
杨海燕, 郭丽, 傅力, 等. 辣椒碱的抗菌研究[J]. 新疆农业大学学报, 2002, 25(4): 63-66. YANG H Y, GUO L, FU L, et al. Research on antimicrobial action of capsaicin[J]. Journal of Xinjiang Agricultural University, 2002, 25(4): 63-66. (in Chinese) DOI:10.3969/j.issn.1007-8614.2002.04.016 |
| [12] |
魏玉西, 帅莉, 郭道森, 等. 辣椒碱的抑菌活性研究[J]. 食品科学, 2006, 27(8): 76-78. WEI Y X, SHUAI L, GUO D S, et al. Study on antibacterial activity of capsaicin[J]. Food Science, 2006, 27(8): 76-78. (in Chinese) DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2006.08.013 |
| [13] |
康雅.辣椒提取物的分离纯化及生物活性研究[D].重庆: 西南大学, 2011. KANG Y. Separation, purification and biological activity of capsicum extract[D]. Chongqing: Southwest University, 2011. (in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10635-1011113943.htm |
| [14] |
LIU C X, LIU R C, ZHANG P, et al. Separation of capsaicin from capsaicinoids by macroporous resin adsorption chromatography[J]. J Sep Sci, 2015, 38(23): 4141-4145. DOI:10.1002/jssc.201500871 |
| [15] |
王涛, 薛淑好. 菝葜乙酸乙酯提取物抑菌作用研究[J]. 医药论坛杂志, 2006, 27(21): 23-25. WANG T, XUE S H. Growth inhibition of ethylacetate extraction of smilax chinal on bacterium[J]. Journal of Medical Forum, 2006, 27(21): 23-25. (in Chinese) |