化石能源的枯竭和日益严重的环境污染问题阻碍着社会经济的可持续发展，因此，寻找清洁可再生能源具有重要意义。木质纤维素作为一种丰富的可再生有机碳源，年产量约1 700亿吨，能够生产燃料和高附加值化学品，已引起了人们的极大关注[1]。然而，截至目前只有约3%的木质纤维素被利用[2]，究其原因是木质纤维素结构紧密、组成复杂[3]，难以实现组分分离和酶的高效糖化。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素、木质素3种含氧高分子有机聚合物组成，通常纤维素含量为30%~50%，半纤维素含量为20%~25%，木质素含量为15%~30%[4]。因此，对木质纤维素组分进行有效分级分离，是其高效利用的前提条件。木质纤维素预处理主要包括蒸汽爆破[5]与利用离子液体[6]、有机溶剂[7]、稀酸和稀碱[8]预处理等方法。然而，这些传统预处理方法存在能耗大、价格昂贵和潜在的环境污染等问题。近年来，低共熔溶剂(deep eutectic solvents，DES)由于具有溶解木质素能力强、绿色无污染等优势，逐渐成为一种良好的生物质预处理溶剂。2003年，Abbott等[9]首次报道了DES的概念，并制备了氯化胆碱与尿素物质的量比1:2的DES溶剂。随后，Francisco等[10]首次利用苹果酸-脯氨酸DES溶解木质素，当苹果酸-脯氨酸物质的量比1:3，温度100 ℃时，木质素溶解度为14.9%。Fang等[11]利用氯化胆碱-甘油按物质的量比1:2制备DES，并对木质纤维素进行预处理，残渣中纤维素含量34.4%，木质素移除率22%。Procentese等[12]利用氯化胆碱-咪唑物质的量比3:7制备DES预处理木质纤维素，木质素移除率23.8%，残渣中纤维素含量41.1%。为了进一步开发更高效率的DES溶解木质素，实现“三素”分离的DES预处理方法，本文制备并筛选了6种DES溶剂，对5种生物质原料进行预处理以评价它们的“三素”分离效果；以优选的DES预处理玉米芯，优化预处理工艺参数，获得最佳工艺条件。另外，还初步研究了残渣纤维素的酶解糖化效果和糖化的影响因素，以期为木质纤维素的生物炼制提供技术基础。
1 实验部分 1.1 材料乳酸、甲酸、草酸、乙酸、甘油、乙醇、浓硫酸均为分析纯，北京化工厂；氯化胆碱、甘氨酸均为分析纯，国药集团药业股份有限公司；稻壳(RH)和玉米芯(CB)，湖南农业科学院核农所；800 kGy处理玉米芯(800 kGy CB)，为经800 kGy高能辐射的玉米芯原料，湖南长沙辐照中心；杉木(CEW)和樟木(CAW)，广西高峰林场。
1.2 DES的制备与筛选 1.2.1 DES的制备按照表 1所示配制6种DES溶剂。在圆底烧瓶中加入一定物质的量比的氢供体和氢受体试剂，60 ℃下恒温搅拌2 h，即得室温下呈液态的DES溶剂。氢供体试剂为草酸、甲酸、乙酸、乳酸和甘油，氢受体试剂为甘氨酸和氯化胆碱。
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下载CSV 表 1 DES溶剂的制备 Table 1 DES preparation and its ingredients |
为了评价辐照处理对预处理木质纤维素分离“三素”效果的影响，对玉米芯进行辐照处理[13]：将玉米芯切成5~10 cm碎片，用60 Co-γ辐照进行处理，辐照剂量约为800 kGy，每次处理原料2 kg，处理时间20 d。生物质原料组分测定参照美国国家可再生能源实验室方法[14]。木质素含量采用酸不溶性木质素表示，酸水解后，糖含量采用1500型高效液相色谱(HPLC，美国科学系统仪器公司)测定。HPLC分析条件为：示差折光检测器和紫外检测器，色谱柱HPX-87H，柱温箱55 ℃，流动相5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，示差检测器温度40 ℃，紫外检测器波长210 nm。
1.2.3 DES筛选以稻壳为原料，初步筛选表 1所列6种DES脱木质素效果。称取8 g稻壳、80 g DES于500 mL圆底烧瓶中，115 ℃油浴加热搅拌反应6 h。反应结束后，趁热过滤，DES淋洗3次。残渣用去离子水洗涤3次，冷冻干燥再于105 ℃烘干，用于组分测定(操作同1.2.2节)，评价“三素”分离的效果。
1.2.4 DES预处理生物质效果评价利用1.2.3节筛选出的3种DES (FaCh、AaCh、LaCh)预处理不同生物质原料(玉米芯、杉木、樟木、800 kGy玉米芯)，脱除木质素，进一步优选出最适DES试剂。
1.3 FaCh预处理玉米芯的工艺参数优化FaCh预处理玉米芯的工艺参数优化方案见表 2，主要影响因素包括反应温度、时间及投料量(固体原料相对于DES溶液的质量分数)。
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下载CSV 表 2 FaCh预处理玉米芯的工艺参数优化方案 Table 2 Experimental design of FaCh pretreatment of the corncob |
取残渣纤维素100 mg加入至15 mL离心管中，再加入5 mL柠檬酸缓冲液和2 mg纤维素酶蛋白。将离心管固定在转盘上旋转，转速180 r/min，在50 ℃下糖化72 h，利用HPLC测定酶解液中的糖含量。
1.5 糖化影响因素分析通过1.4节残渣纤维素酶解糖化实验，得到不同预处理条件的纤维素残渣，分别再用50 mmol/L、pH 4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗涤3遍。称取不同预处理条件下所得纤维素残渣100 mg，加入50 mL的离心管中，按照每g纤维素20 mg酶蛋白的标准加入纤维素酶，再加入10 mL、50 mmol/L、pH 4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；混合均匀再放入摇床(50 ℃，180 r/min)中，吸附反应5 h后离心取上清液。分别取1 mL上清液与5 mL事先准备好的考马斯亮蓝溶液混合，反应2 min，用紫外分光光度计测定吸光度，再依据标准曲线计算蛋白含量。
将未经处理的玉米芯和纤维素残渣均匀地贴在有双面胶的金属样品台上，固定、喷金。随后于扫描电子显微镜下观察样品的形貌结构，照片放大倍数为3 000倍。
将50 mmol/L、pH 4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液与低共熔溶剂一起配置低共熔溶剂质量分数分别为1%、2%、5%、10%、20%、30%的缓冲液，并用NaOH调节pH为4.8。在50 mL离心管中加入5 mL的缓冲液(低共熔溶剂与50 mmol/L、pH 4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的混合液)、1 g的微晶纤维素，再加入20 mg纤维素酶。混合均匀再放入摇床(50 ℃，180 r/min)中，糖化72 h后取出，用HPLC测定反应液的糖释放量。
利用XRD-6000 X-射线衍射仪(日本岛津公司)对DES预处理前后的玉米芯进行XRD分析，以10(°)/min从10°扫描至40°，间隔0.02°，扫描电压40 kV，扫描电流40 mA。结晶度利用高度法计算[15]，如式(1)所示
| $ C = \left( {{I_{002}} - {I_{{\rm{am}}}}} \right)/{I_{002}} \times 100\% $ | (1) |
式中，C为结晶度；I002为002区的晶格衍射强度(2θ=22.6°)；Iam为无定形区强度(2θ=18°)。
1.6 FaCh溶解木质素的回收FaCh预处理玉米芯原料后，过滤，向滤液中加入3~5倍的乙醇/水溶剂(体积比9:1)[16]，静置过夜，木质素沉淀析出，使用冷冻高速离心机离心得到木质素。将木质素置于恒温干燥箱中，105 ℃干燥4 h，测定其纯度。按式(2)计算木质素移除率[17]。
| $ R=\left( 1-\frac{{{m}_{残渣}}}{{{m}_{原料}}} \right) \times 100\% $ | (2) |
式中，R为木质素移除率；m残渣为残渣木质素质量，g, m原料指生物质原料中木质素质量，g。
离心得到的滤液用于总糖含量的测定：取3 mL滤液至15 mL耐压瓶中，加入105 μL 72%的硫酸混合均匀，在高灭菌锅中121 ℃水解60 min，冷却后采用HPLC定量测定糖含量。
2 结果与讨论 2.1 DES溶解木质素效率如图 1所示，由于氢受体与氢供体混合加热后氢键的相互作用，DES在室温下呈现为透明液体状态[17-18]。木质纤维素原料(稻壳、玉米芯、800 kGy玉米芯、杉木、樟木)组分测定结果见图 2。用1.2.1节中6种DES预处理稻壳生物质评价DES分离“三素”效果，以优选出最适DES溶剂。从图 3可知，溶解木质素最好的前两位DES溶剂为FaCh和LaCh，它们移除木质素的效率分别为61.58%和51.82%。研究表明，DES在预处理木质纤维素过程中，生物质结构中连接纤维素与木质素的半纤维素被降解，从而使木质素与纤维素分离；连接木质素与半纤维素的酯键也被打断，从而使木质素与半纤维素分离[19]；在DES溶剂中，半纤维素水解为低聚糖；通过氢键和π—π键相互作用，DES溶解木质素，并使其发生部分解聚[20]。Alvarez-Vasco等[16]利用DES预处理杨木生物质，在分离纯化木质素过程中将木质素大分子内醚键打断，得到分子量890 g/mol的木质素，相比于未处理木质素的分子量(2 950 g/mol)要小得多。
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图 1 DES溶剂 Fig.1 Pictures of DES solvents |
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图 2 原料组分测定 Fig.2 Composition of biomass feedstocks |
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图 3 DES预处理稻壳的木质素移除率 Fig.3 Removal of lignin from rice bran by DES |
由于稻壳含有大约20%的硅在纤维素周围与半纤维素和木质素相互连接[21]，DES预处理过程不能有效破坏木质纤维素的刚性结构，导致预处理效果不好。采用酸或碱预处理生物质时，禾本科类生物质结构相对于软木和硬木更容易被破坏[22]。综上，优选出LaCh、FaCh溶剂进行后续实验。
2.2 DES分离生物质“三素”组分通过2.1节优选出的2种DES溶剂，即LaCh和FaCh，以脱稻壳木质素效果最差的AaCh为对照，探讨DES预处理其他木质纤维素原料，分级分离“三素”效果，结果见图 4(a)和(b)。在对4种原料(玉米芯、稻壳、杉木、樟木)的DES预处理中，LaCh、AaCh和FaCh处理玉米芯得到的残渣纤维素含量很高，脱木质素效果明显好于其他生物质原料，残渣纤维素含量分别为52.99%，68.74%和73.20%(图 4(a))，木质素移除率分别为68.9%，70.06%和84.29%(图 4(b))。这是因为FaCh中较强的氢键能在短时间内将半纤维素水解，并通过氢键和π—π键的相互作用溶解木质素。
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图 4 DES分离生物质“三素”组分 Fig.4 Efficiency of lignin removal from biomass by DES |
以玉米芯原料为对象，比较了辐照预处理对DES分离“三素”效果的影响，结果见图 4(c)。玉米芯经辐照处理后，残渣纤维素含量几乎没有变化[23]，木质素的移除率有所增加，其中FaCh脱除木质素效率最高，为89.55%(图 4(b))。Yin等[24]的报道中提到，辐照处理在一定程度上有利于木质素的脱除和提高残渣纤维素的酶解糖化效果。木质素的脱除效果主要取决于木质素与半纤维素的分离以及溶剂对木质素的溶解能力。有文献报道，DES对木质素有较好的溶解能力，木质素溶解度能达每g DES 14.9 g木质素[10]。
综上，FaCh分级分离玉米芯的“三素”效果最佳。
2.3 FaCh分离玉米芯“三素”工艺优化FaCh分离“三素”的主要影响因素包括时间、温度和投料量，按照表 2的实验方案设计，对上述因素进行单因素优化，以期获得最适工艺参数。
2.3.1 预处理时间固定玉米芯8 g，FaCh 80 g，反应温度115 ℃的条件下，优化处理时间(360 min、240 min、120 min、90 min、60 min、30 min)对木质素移除率和组分流向的影响，结果见表 3。从表 3可以看出，处理时间增加到120 min后纤维素含量明显提高，继续增加处理时间，残渣纤维素含量并没有明显提高。由于甲酸的水解作用，半纤维素和少量纤维素被水解成单糖和低聚糖，木质素移除率随着时间延长而增加，当处理时间为120 min时，纤维素含量为74.31%，木质素移除率为81.48%。根据以上结果最佳时间确定为120 min。根据Vasco等[16]的报道，采用LaCh在145 ℃下预处理白杨木360 min，木质素移除率为78.50%。由此可见，本文FaCh的预处理效果较好。
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下载CSV 表 3 FaCh预处理玉米芯优化过程中组分流向与木质素的移除率和纯度 Table 3 Composition, lignin removal ratio and purity of corncob pretreated with FaCh |
固定玉米芯8 g，FaCh 80 g，反应时间120 min等条件，优化反应温度(130 ℃，115 ℃，100 ℃，85 ℃，70 ℃)对木质素移除率和组分流向的影响，结果见表 3。对比方案7(反应温度70 ℃)和10(反应温度115 ℃)，温度升高到115 ℃后，残渣纤维素含量明显增加(从约34%提高到约74%)，进一步升高温度至130 ℃，残渣纤维素含量并没有增加(为73.74%)。木质素移除率受温度影响较大，100 ℃时，约50%的木质素被移除，温度升至115 ℃，木质素移除率达81.48%。但是预处理温度过高会加剧半纤维素水解物C5糖转化呋喃类物质糖醛并吸附在残渣纤维素上，抑制后续糖化过程中的酶活性[25]。因此，最佳处理温度确定为115 ℃。
2.3.3 原料投料量固定反应温度115 ℃，反应时间120 min，FaCh 80 g等条件，优化玉米芯原料投料量(9.6 g，8 g，6.4 g，4.8 g)对木质素移除率和组分流向的影响，结果见表 3。当投料量为12%时，纤维素的含量由最高的74.31%降至57.10%，木质素移除率从最高时的81.4%降低至70.32%，半纤维素也没有完全水解，未水解的半纤维素与纤维素、木质素以一定的刚性结构存在，预处理效果不理想。分析原因，可能是FaCh溶剂具有一定黏度(29.90 mPa·s, 115 ℃)，投料量过大会导致搅拌不均匀，FaCh溶解木质素效果差，影响预处理效果。当投料量为10%时，半纤维素完全水解。因此，最佳投料量确定为10%。
2.3.4 实验验证在最优条件(预处理时间120 min、温度115 ℃、投料量10%)下，进行3次验证实验，取平均值。结果表明，FaCh预处理玉米芯后，残渣纤维素含量74.31%，半纤维素全部移除，木质素移除率81.49%，纯度77.07%。
2.4 残渣纤维素的酶解效果及影响因素对FaCh不同预处理条件得到的玉米芯残渣进行酶解糖化，结果见表 4。相对于未处理玉米芯原料(对照组)，FaCh处理后残渣纤维素酶解率得到提高。酶解糖化效果最好的是方案5，糖化率为98.56%，其次为方案4，糖化率为93.23%。
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下载CSV 表 4 FaCh预处理玉米芯所得残渣纤维素的酶解效果 Table 4 Enzymatic hydrolysis of residue solid of corncob pretreated with FaCh |
木质纤维素经预处理后，半纤维素与木质素的去除使得大部分纤维素发生一定的溶胀，比表面积增加[25]。也有研究报道，即便是木质素在细胞壁的存在位置发生细微的变化，也会使酶解效率得到有效提升[26-28]。不同预处理条件下得到的纤维素残渣对纤维素酶吸附率如图 5(a)所示。未对玉米芯进行任何处理时，其纤维素酶吸附率为18.72%，预处理后纤维素残渣对纤维素酶吸附率均有提高，最高吸附率为24.98%。残渣纤维素对酶吸附率的提高，有利于纤维素酶解糖化。
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图 5 残渣纤维素糖化和结构特性 Fig.5 Saccharification and structural properties of cellulose residue after pretreatment with DES |
SEM分析(图 5(b))表明，未处理玉米芯保留着完整和有序的纤维结构，而DES预处理后，玉米芯原有的纤维结构受到不同程度的破坏。XRD分析(图 5(c))表明，DES处理没有改变纤维素的晶相，处理前后均为天然Ⅰ型纤维素，结晶度分别为41.25%和48.57%，变化不大。这一现象表明，DES对纤维素的结晶状态(包括结晶区和无定形区)影响很小[19-20]。
同时，我们还考察了DES残留对纤维素酶活的影响，结果见图 5(d)。由图可知，当DES残留量低于2%时，糖化6 h后纤维素酶活性不受影响。进一步延长糖时间至72 h，纤维素酶活性降低至原来的80%左右。
3 结论(1) 从6种DES溶剂中筛选两种分离“三素”效果较好的DES即LaCh、FaCh，以这2种DES预处理樟木、杉木、玉米芯、稻壳、800 kGy玉米芯等5种生物质原料，结果表明，FaCh预处理玉米芯的“三素”分离效果最佳。
(2) FaCh预处理玉米芯最优工艺参数为：时间120 min，温度115 ℃，投料量10%。在此条件下，残渣纤维素含量74.31%，木质素移除率81.49%，木质素纯度77.07%。
(3) 对DES预处理玉米芯残渣进行酶解糖化，最高糖化率为98.56%。SEM分析显示，DES预处理使纤维素结构发生断裂。XRD分析结果表明，DES预处理不会改变纤维素晶型。
(4) DES预处理后，残渣纤维素对酶吸附效率有所提升。当DES残留含量低于2%时，糖化6 h后纤维素酶活性不受影响。
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