材料表面的可控引发接枝聚合是一种重要的表面改性方法。近20年来,以原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-断裂链转移自由基聚合(RAFT)、氮氧稳定自由基调控聚合(NMP)等为代表的活性自由基聚合技术由于可以方便实现表面引发接枝聚合,已成为修饰各类材料表面的有力工具[1]。然而上述聚合方法多以非生命物质为修饰对象,较少用于生物活性物质存在下的反应,其根本原因在于聚合反应条件所涉及的高温、有机溶剂、强氧化剂(氧化还原引发剂)、过渡金属(ATRP中用于调控聚合过程)及苛刻的除氧操作等条件容易造成生物活性物质的失活。故需要开发新的能够在室温或低温、水相和生理pH值、氧气存在的条件下实施的表面引发接枝聚合方法,在不损害生物活性物质的前提下实现表面修饰反应。与传统的热化学聚合体系相比,光引发聚合体系在满足上述要求方面具有突出的优势:(1)反应活化能低,可以低温聚合;(2)已有多种无毒或低毒的光引发剂,可以在水相中实施高效光聚合反应;(3)很多光聚合体系具有较好的氧气耐受性,可以在空气氛围下进行[2]。此外,光聚合反应还具有独特的优点:(1)可以通过开/关光源快速实现反应的启动和停止;(2)具有区域可控性,可使聚合反应只发生在光照区域;(3)能够实现热化学方法难以达成的引发反应。基于光引发的基本机理,Yang和Rånby[3]首次提出了两步法活性光接枝聚合的理念:半频哪醇光敏基团作为“休眠”基团被引入聚合物基材面,在紫外光照下,休眠基团的弱键被激发,断裂形成表面自由基,引发活性接枝聚合。然而紫外光的能量较高,长时间辐照不仅会导致C—C键断裂,引发副反应,而且会造成生物活性物质失活(如蛋白质)或死亡(如细胞)。针对这一问题,结合多年在有机材料表面光接枝改性方面的工作积累,近年来本课题组开发了基于硫杂蒽酮(TX)衍生物的可见光表面活性接枝聚合新体系。相比于紫外光,可见光的波长更长,能量更低,具有穿透性强、副反应少、不释放臭氧、辐照安全、对生物活性物质无损害等优点,在生物相关领域具有更广阔的应用前景。本文将对相关方法涉及的反应机理及其在酶固定化、生物芯片及细胞包覆方面的应用进行介绍,并展望了今后的发展前景。
1 可见光引发活性接枝聚合新体系传统的NorrishⅡ型光接枝反应中,羰基化合物光敏剂(如二苯甲酮,BP)在紫外光照射下吸收光子经能量跃迁(n→π*)激发到单线态(BPS),单线态迅速经系间窜越(ISC)转变为比较稳定的三线态(BPT),进而从基材(作为氢供体)表面夺取氢原子生成两种自由基:表面自由基和半频哪醇自由基[4]。在单体存在下,表面自由基可以引发接枝聚合,而半频哪醇自由基被共轭作用稳定,易与增长自由基偶合而非引发聚合反应。当反应体系中无单体时,光反应生成的半频哪醇自由基直接和表面自由基偶合形成休眠基,由此构成了活性光接枝聚合的化学基础。异丙基硫杂蒽酮(ITX)作为一种典型的商用NorrishⅡ型光敏剂,具有感光度高、引发速率快的优点,已被广泛应用于光固化油墨、涂料、粘合剂等行业,但在表面光接枝聚合领域,仍缺乏对ITX的相关研究。基于上述两步法光接枝原理,本课题组Bai等[5]发展了一种利用ITX为光敏剂的新的活性光接枝聚合体系(图 1)。该体系和BP体系最大的不同点在于ITX半频哪醇休眠基具有更大的立体空间位阻,这一特征使其光裂解波长扩展到了可见光区, 由此即可使用该体系进行可见光引发活性接枝聚合反应。在此基础上,本课题组进一步发展了这种方法,研究了双官能团单体聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)在基材表面的可见光引发表面活性接枝行为,发现接枝的PEG交联网络层具有均匀致密、厚度可控、亲水不溶胀、抗蛋白非特异性吸附及细胞粘附、表面残留休眠基可二次引发接枝等特点,本课题组将其命名为PEG“分子网布”[6]。结合可见光引发条件温和的优势,本课题组将该表面交联接枝策略用于酶固定化、生物芯片及细胞包覆等方向,取得了一系列创新性的成果。
虽然紫外光引发的聚合反应已成为材料合成领域的有力工具,但高能量的紫外光辐照限制了其在生物医学领域的应用。紫外光辐照可以导致DNA损伤、蛋白质变性和细胞死亡。研究表明,在20 mW/cm2的紫外光辐照强度下,60%的蛋白质在1 min内会失活,而100 s后有80%的蛋白质失活[7]。因此,本课题组提出的可见光活性接枝聚合技术不仅能够进一步丰富表面光接枝改性策略,而且对开发具有实用价值的、有生物活性分子参与的接枝聚合反应意义重大。
2.1 酶固定化利用酶为催化剂的化学反应具有催化效率高、底物专一、反应条件温和等优点,是实现绿色化学、可持续发展的重要技术手段,在化学合成、生物化工、生化分析及制药等领域具有广阔的应用前景。游离状态的酶存在易变性的缺点,在高温、强酸、强碱、紫外线等环境下易失去催化活性,并且在反应后仍存在于溶液中不易分离,不仅污染产物,也因不能重复利用而使成本提高,不利于其实际应用。通过对酶的固定化,可使其易与产物分离,能够回收利用,并可提高酶的稳定性,极大降低实际生产成本。
包埋法是固定化酶的常用方法之一,由于酶通过物理作用而非化学偶联的方式被限制在载体材料网络中,可以最大限度保持酶的活性,并且可实现较大的载酶量。通常使用水凝胶作为包埋法固定化酶的载体,并且包埋量也不受反应活性的限制。但是传统水凝胶在溶胀状态下机械强度较低,很容易被破坏,这在一定程度上限制了它的应用。基于此背景,本课题组通过可见光表面接枝聚合的方法在聚合物基材表面制备了交联结构的PEG“分子网布”接枝层用于酶的原位包埋固定化。与传统水凝胶相比,该PEG“分子网布”具有交联网孔均匀致密(小于酶或适度交联酶的分子尺寸)、亲水但不溶胀的特点,可以确保包埋酶不会因为凝胶溶胀而释放,并且可见光反应条件温和,非常适合包埋过程酶活性的保持。以脂肪酶为模型(图 2),通过控制接枝反应时间、单体溶液中PEGDA的含量以及接枝反应的加液量,可以对接枝厚度范围进行大规模精确控制(10-1~103 μm)[8]。对比不同光源下固定化酶的活性,发现使用可见光辐照2 h的活性是使用紫外光辐照150 s活性的5倍。该方法对脂肪酶的固定化率可达89%,且固定化酶的复合膜重复使用7次活性保持不变,显示了良好的可重复使用性。
以实心聚合物膜为载体材料时,提高PEG交联网络接枝层厚度可以增大酶的固定化密度,但是接枝层过厚时容易产生与基材剥离的问题。为了在高的酶固定密度前提下保持接枝膜的机械强度,本课题组采用多孔的聚丙烯无纺布作为载体材料,利用可见光活性接枝聚合技术原位将β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶固定于PEG交联网络中。由于接枝交联层以填充方式分布于无纺布骨架周围,能够同时保证其具有较高的机械强度和理想的接枝层厚度(即较高的酶固定密度)。此方法同样可以有效保留酶的活性,而且具有良好的重复利用性能,重复利用50批次后酶仍保持了60%以上的活性[9-10]。
按照活性聚合的机理,接枝PEG“分子网布”后的接枝层表面仍应含有活性的ITX半频哪醇休眠基,在不加引发剂条件下,可再次引发单体的接枝聚合反应,通过对接枝层表面的元素分析也证实了这一推测。基于该特点,利用光掩膜依顺序多次接枝的方法,可在基材表面形成具有多层次复杂结构的微阵列(图 3)[11]。
多酶系统的固定化是近年来研究的热点方向之一。对于多酶之间具有协同作用或不会相互抑制的体系,采用与单酶固定类似的混合酶固定策略是最为简单有效的途径。然而,对于两种相互抑制的酶来说,混合固定则会导致多酶之间的互相干扰,影响最终的反应效率。针对此问题,结合上述制备表面复杂结构微阵列的研究基础,本课题组提出了在同一聚合物基材表面利用可见光活性接枝聚合分区域固定化两种酶的策略[12-13]。根据表面接枝聚合“活性”的特点,先通过接枝聚合将第一种酶原位固定在第一层图案化的PEG交联网络中,进而实施第二次接枝聚合,将第二种酶固定在第二层图案化的交联网络中。这种分隔固定化的策略,首先可以避免多个酶之间的互相干扰,保持相对独立性;其次可以确保多个酶之间的距离接近,减少中间底物的传递路径,提高协同催化效率。在以胰蛋白酶和谷氨酰胺转移酶(TGase)为模型的多酶体系中,当胰蛋白酶与TGase共存时,TGase会交联牛胰蛋白酶上的赖氨酸与谷氨酰胺造成牛胰蛋白酶的部分失活;与此同时,牛胰蛋白酶也会水解TGase上的精氨酸造成TGase的部分失活。分隔共固定化酶和混合共固定化酶的活性对比结果表明,分隔共固定化酶在最适温度(40 ℃)下的活性提高了35%。
2.2 蛋白微阵列由前述结果可知,经可见光接枝改性后的聚合物基材膜依然保留有再引发的能力,可再次实施可见光引发表面活性接枝聚合。通过这项技术,可以实现一些新的表面修饰策略,比如亲水性表面再覆盖疏水性微阵列层、抗蛋白非特异性吸附表面再接枝反应性微阵列等,为表面改性的研究开拓了新的设计思路。基于此理念,本课题组设计了一种简单的方法制备低背景高灵敏度的生物芯片[14]。首先在低密度聚乙烯(LDPE)膜表面接枝PEG聚合物刷(或是交联接枝层),随后以其为基材,直接以可见光为激发源,引入光掩膜对基材表面进行局部再引发交联接枝聚合反应。在第二步反应体系中,单体溶液包括PEGDA和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)。PEGDA作为一种交联剂,有使微阵列结构结构更稳定、厚度提高的功能,同时也能使微阵列结构有一定的亲水性。GMA则引入了环氧基团,使功能性凝胶微阵列具备固定生物大分子的功能。由此在塑料基材表面同时完成了抗蛋白非特异性吸附改性和环氧官能化改性,并引入了三维微阵列图案。为了验证制备的微阵列的抗蛋白质非特异性吸附特性,对比了有无PEG接枝层的两种微阵列固定蛋白质的效果(图 4)[14]。有抗污染层的蛋白质芯片荧光强度达到120 a.u.,背景信号低,更有应用潜力;无抗污染层的蛋白质芯片荧光强度为50 a.u.,大量的蛋白质被非特异性吸附在膜背景处,造成背景荧光干扰严重,影响观察,不利于应用。而且利用该方法的活性特征,通过改变光辐照时间或单体浓度,可以控制微阵列的环氧基团的密度,从而使蛋白质的固定密度得以有效控制。
采用图 3所示方法,本课题组制备了能够同时检测两种蛋白的复杂表面微阵列结构[11]。首先用丙烯酸(AA)与GMA作为功能单体、PEGDA作为交联剂制备双层复杂图案,即在垂直的条纹图案上接枝横向条纹图案,将生物素和免疫球蛋白固定在限定的区域内。固定后的荧光图像显示生物素微区可以与目标蛋白绿色荧光标记的亲和素反应,免疫球蛋白(IgG)微区与红色荧光标记的目标蛋白anti-IgG反应,表明靶蛋白质分子已经成功地键合在特定的微区上,显示了较好的特异性(图 5)。
具有外界刺激响应性(如温度、pH)的智能型水凝胶是药物控制释放体系的理想载体材料之一。厚度在微米级及以下的凝胶膜由于具有更快的响应速度受到广泛的关注。本课题组采用可见光活性接枝聚合技术,在可生物降解的聚己内酯(PCL)基膜上以丙烯酸钠为单体,PEGDA为交联剂,制备得到纳米尺度、厚度可控的pH敏感水凝胶薄膜,并用于蛋白质的原位包埋[15]。接枝膜在pH 7.4和pH 2.0下的水接触角分别为(18±3)°以及(38±2)°,显示了良好的pH响应性。由于PCL基膜的限制,凝胶层的溶胀只发生在纵向方向,横向不发生溶胀,因此其溶胀率仅有30%,远远低于本体水凝胶的190%的溶胀率。水凝胶薄膜对蛋白的释放具有pH敏感性,在pH 2.0的环境下24 h后对溶菌酶的累计释放量是相同时间下在pH 7.4的环境下释放量的12倍以上。释放的蛋白质的生物活性仍然与原蛋白一致,表明此方法是一种温和、简单的负载并控制释放蛋白的新策略,在生物医用材料领域具有较好的应用前景。
2.4 细胞包覆/固定化由柔性交联聚合物网对细胞进行包埋的方法已在生物质转化、组织工程等领域广泛应用。而为了有效地保持细胞活性,要求固定化交联包埋过程中聚合反应条件足够温和;形成的交联聚合物网具有良好的生物相容性和柔软性,能够为细胞包埋提供优良的微环境。基于此,本课题组采用聚丙烯无纺布为骨架,以可见光活性表面接枝交联聚合方法制备PEG交联网络将酵母细胞原位包埋固定化[16]。此固定体系的优势有:(1)在室温下通过可见光引发,固定化条件温和,能最大限度地保持细胞活性;(2)相比于传统紫外引发及热引发体系,可见光引发使得体系内的自由基浓度较低,从而更有利于保持细胞活性;(3)采用柔韧性良好的无纺布作为PEG接枝层的骨架,提高了固定化体系的机械性能,有利于长期重复发酵;(4)PEG交联层具有优异的生物相容性;(5)膜状的固定化体系使得固定化包埋的细胞容易分离。通过对酵母细胞固定化体系进行表征,发现少数酵母细胞固定在膜的表层,绝大部分均匀分布在固定化体系的内部,包埋酵母细胞保持了良好的细胞活性(图 6)[16]。固定化酵母细胞发酵结果表明其转化葡萄糖为乙醇的产率可达88.2%。经紫外光接枝包埋的酵母细胞的乙醇产率只有相同条件下使用可见光聚合包埋的1.12%,证实了可见光引发的优越性。固定化体系在重复使用25个批次(每个批次24 h)的间歇重复发酵过程中,相对乙醇产率维持在(80.7±0.4)%到(95.5±6.3)%,发酵稳定性良好,说明酵母细胞在PEG分子网布内保持了较好的活性。
在单细胞表面修饰有机或者无机的人造壳可以有效地帮助细胞抵挡外界环境的变化,从而增强细胞抵抗外界环境的能力,并在细胞治疗、生物催化、细胞传感器以及组织工程等方面得到了广泛的应用。目前为止,单细胞表面人造壳的方法主要有层层自组装、生物矿化和表面引发自由基聚合等。相比于采用物理的方法,采用化学的方法在细胞表面接枝一层聚合物壳层不仅可以为细胞提供稳定的保护,而且还可以用于后期的化学修饰,为细胞表面的功能化提供基础。采用化学方法修饰细胞表面的关键在于化学修饰过程的反应条件必须足够温和,这样才不会导致细胞活性的损失。本课题组利用可见光活性接枝聚合实现了细胞表面厚度可控的聚合物层的构建(图 7)[17]。首先将聚乙烯亚胺(PEI)通过静电作用吸附于细胞表面,随后将水溶性引发剂硫杂蒽酮儿茶酚-O′O-二乙酸(TX-Ct)通过羧基和氨基作用偶合在细胞表面,这样组成了TX-Ct/PEI引发体系。在可见光的照射下,TX-Ct/PEI引发体系会在细胞表面引发聚合形成聚合物层。本课题组探究了TX-Ct/PEI可见光引发体系的动力学特征,证明其属于可控/活性自由基引发体系。这样通过该引发体系所制备的聚合物层也就实现了厚度的可控。通过对细胞活性的测试证明了该方法在聚合完成后可以有效地保留细胞的活性(>85%)。由于聚合物层的作用,实现了细胞增殖的可控,增强了细胞抵御溶壁酶的能力。
综上所述,可见光活性接枝聚合新技术可以全面解决传统表面接枝聚合所涉及的高温、过渡金属、紫外辐照等生物活性物质相容性问题,推动表面接枝聚合在酶固定化、药物控制释放、蛋白质芯片及细胞表面工程领域的应用。然而由于可见光活性接枝聚合方法仍处于发展阶段,该领域未来的研究需要关注以下问题: (1)开发新的可见光引发体系,进一步提高光敏剂分子的感光效率及在可见光区的最大吸收波长;(2)开发细胞相容性更好的光敏剂分子;(3)进一步提高引发反应效率;(4)进一步提高聚合反应速度;(5)开发能耗更低、效率更高的可见光光源。相信随着此领域相关研究的不断深入, 上述所涉及的科学和技术问题会逐步得以解决, 最终构造系统的可见光活性接枝聚合技术平台,形成实验室和工业上通用的表面改性方法。
团队简介
有机材料表面科学与工程实验室是教育部“211”工程建设项目“聚合物表面分子工程”的主要单位,属化工资源有效利用国家重点实验室。实验室主任为杨万泰院士,现有教师7人,研究生34人,拥有SEM、AFM和GPC等仪器设备20余台,近年来已申报专利100多项、发表SCI收录论文500余篇。
实验室主要从事可控表面接枝聚合及表面改性形态与性能调控、可控/活性自由基聚合、先进高分子材料的合成等基础及应用研究。经过多年探索,提出“表面受限反应”概念和实施方法,由此发展了一整套光催化表面C—H键转化新反应体系,可对聚烯烃等各种高分子进行多层次表面改性。在聚合领域,建立了基于环状芳香频哪醇调节的有工业意义的可控/活性自由基聚合新方法,可制备分子量可控水溶性聚合物和各种功能共聚物。在非均相聚合领域,建立了自稳定沉淀聚合绿色新技术,不仅可制备尺寸可控的微/纳粒子,还为解决“全球巨量废弃烯烃利用”难题提供了新途径。目前多项专利成果已进入工业应用。
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