骨组织工程支架由于要为缺损组织提供支撑，需要具备一定的力学强度，除此之外还需要具备一定的孔隙结构，为缺损的组织细胞的增殖、分化提供外部环境，并最终达到修复损伤组织的目的。因此，骨组织工程支架除了需要使用生物活性材料外，还需具备一定的宏观和微观结构。不同的损伤部位所需支架的空间结构不同，目前没有统一的标准，一般认为孔径在100~500 μm之间较好，有利于细胞的增殖、迁移和营养物质的输送[1-3]。可生物降解的聚合物聚己内酯(PCL)由于具有良好的生物相容性和形状保持性能，被广泛用于在组织工程中制造不同类型的支架。但用于骨组织工程时，由于PCL的生物活性不够，新骨组织不能与聚合物表面紧密结合。而羟基磷灰石(HA)具有高生物活性，一直以来被用作骨代替材料[4-7]。因此，HA/PCL复合材料可有望结合两种材料的生物相容性、生物可降解性和力学性能的优势[8]。郭凌云等[9]以羟基磷灰石和聚己内酯为原材料，采用选择性激光烧结技术制备纯PCL支架以及HA质量分数分别为5%和10%的HA/PCL支架，并分析了支架的宏观和微观结构、抗压强度、孔隙率和亲水性等。Huang等[10]利用电机助推挤出成型(MAM)打印HA浆料，制备生物组织工程支架，由于浆料的主要材料为纳米羟基磷灰石材料，容易产生团聚，从而使挤出过程易发生堵塞现象。Zein等[11]和Cao等[12]以PCL丝料为原料，通过熔融沉积成型(FDM)工艺制备了生物组织支架，然而纯PCL材料的生物活性不够，并且FDM熔丝在材料选择的自由度上很受限制。Zhao等[13]利用浸渍法成功制备了HA/PCL生物组织支架，然而强度仅为(0.57±0.09)MPa。
综合来看，现有的组织工程支架制备工艺存在HA含量较低且易发生团聚、支架强度低、打印材料单一等问题。本文利用北京化工大学自主研发的熔体微分FDM 3D打印机[14]构建nano-HA/PCL和micro-HA/PCL组织工程支架，以HA/PCL复合材料颗粒为打印材料，对比分析了两种组织工程支架的力学性能和结构特点。这种打印方式的优势在于复合材料的制备过程相对简单，在材料的选择上有很大的自由度，另外打印工艺相对简单，组织工程支架的制备周期较短等。
1 实验部分 1.1 实验原料PCL颗粒(PCL6800)，分子量40 000，熔融指数3 g/10 min(160 ℃)，熔点60 ℃，密度1.146 g/mL(25 ℃)，东莞珠峰生物科技有限公司；纳米羟基磷灰石(nano-HA)粉末，多孔颗粒，分子量1 004，熔点1 650 ℃，比重3.16 g/cm3，微米羟基磷灰石(micro-HA)粉末，多孔颗粒，分子量1 004，熔点1 650 ℃，比重3.16 g/cm3，西安沣禾生物科技有限公司。
1.2 主要仪器及设备熔体微分3D打印机[14]，北京化工大学英蓝实验室自主研发，如图 1所示。熔体微分3D打印机原料为粒料，相对于桌面3D打印机省去了拉丝的步骤，节约成本，拓展了3D打印材料的范围。聚合物熔体微分3D打印机的工作原理如图 2所示，将颗粒状的物料或加热后变成熔融态的物料通过螺杆熔融塑化挤出，喷头固定不动，运动平台能够实现3个方向的运动，从而打印制品。
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图 1 熔体微分3D打印机 Fig.1 Melt differential 3D printer |
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图 2 聚合物熔体微分3D打印机工作原理图 Fig.2 The working principle diagram of the polymer melt differential 3D printer |
双螺杆挤出造粒机，Werner & Pfleiderer zgk 25，科倍隆机械设备系统(上海)有限公司；真空干燥箱，DZF-6021，上海鸿都电子科技有限公司；微机控制电子万能试验机，WDT-W-20A, 承德精密试验机有限公司；光学显微镜，JTVMS-1510T, 东莞嘉腾仪器仪表有限公司；扫描电子显微镜(SEM)，S-4700, 日本日立公司；透射电子显微镜(TEM)，JEM-3010，日本电子公司；差热分析仪，DSC-204F，德国Netzsch公司。
1.3 样品制备通过双螺杆挤出机和切粒机分别制备nano-HA质量分数为20%的nano-HA/PCL和micro-HA质量分数为20%的micro-HA/PCL复合材料颗粒。复合材料制备工艺参数为：加工温度150 ℃，螺杆转速50 r/min。打印前将材料在干燥箱中干燥2 h，干燥温度50 ℃。
分别以nano-HA/PCL和micro-HA/PCL复合材料颗粒为原料，通过熔体微分3D打印机制备组织工程支架。为了表征nano-HA/PCL和micro-HA/PCL复合材料支架的力学性能并与纯PCL对比，分别以这3种材料为原料，制备抗拉伸(参照GB/T 1040.2—2006)和弯曲(参照GB/T 9341—2008)试件。打印工艺参数为：喷嘴孔径0.4 mm, 打印速度35 mm/s, 打印层高0.3 mm, 室温20 ℃，熔融温度150 ℃，螺杆转速0.6 r/min，打印过程如图 3所示。
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图 3 3D打印组织工程支架过程 Fig.3 The 3D printing tissue engineering scaffold process |
力学性能测试 采用微机控制电子万能试验机分别对3D打印PCL标准试件、nano-HA/PCL和micro-HA/PCL复合材料标准试件进行拉伸测试和弯曲测试，每组试件分别测试5个平行样品。
光学显微镜观察 通过光学显微镜观察所制备的nano-HA/PCL和micro-HA/PCL复合材料组织工程支架的表面结构，并测量支架孔隙大小。
SEM表征 通过扫描电镜观察复合材料支架的断面和micro-HA的粒径，分析nano-HA和micro-HA在复合材料中的分布情况。
TEM表征 将2 g nano-HA粒子溶解在20 g无水乙醇中，并用超声波清洗机进行分散，将分散均匀的溶液滴在铜网上，通过透射显微镜观察nano-HA粒子的形貌和粒径。
DSC分析 分别取纯PCL、质量分数为20%的nano-HA/PCL和micro-HA/PCL复合材料2~5 mg进行DSC测试，第1次升温至150 ℃，然后在氮气气氛下以10 ℃/min的速度冷却至-20 ℃，并再次以10 ℃/min的速度加热到150 ℃, 得到DSC曲线。
2 结果与讨论 2.1 micro-HA和nano-HA的微观形貌micro-HA和nano-HA的微观结构如图 4所示。由图 4(a)可知, micro-HA为直径在5~40 μm的近似球形粒子，其中含有部分形状不规则的碎屑；由图 4(b)可知，nano-HA为长度在20~150 nm的短棒状颗粒。
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图 4 micro-HA和nano-HA的微观形貌 Fig.4 Micromorphology of micro-HA and nano-HA |
纯PCL, nano-HA质量分数为20%的nano-HA/PCL和micro-HA质量分数为20%的micro-HA/PCL复合材料的降温结晶曲线如图 5所示。由图 5可知，纯PCL, micro-HA/PCL和nano-HA/PCL复合材料的结晶峰温度分别为22 ℃，30 ℃和33 ℃。
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图 5 PCL和HA/PCL结晶温度 Fig.5 PCL and HA/PCL crystallization temperature charts |
HA/PCL复合材料的结晶峰温度比纯PCL的要高，这是因为HA的加入使得PCL分子链吸附在HA表面成核，起到了异相成核的作用，因此提高了PCL的结晶速率和结晶能力。
纯PCL, nano-HA/PCL和micro-HA/PCL复合材料的DSC二次升温曲线如图 6所示，纯PCL, micro-HA/PCL和nano-HA/PCL复合材料的熔融温度分别为58 ℃，59 ℃，60 ℃。材料熔融温度随着HA的加入而升高，这是因为PCL含有完善程度不一的晶体，在温度升高的过程中完善程度低的晶粒稳定性差，熔融温度低，HA的加入提高了PCL晶体的完善度，从而提高了复合材料的熔融温度。
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图 6 PCL和HA/PCL的二次升温曲线 Fig.6 Second heating curves for PCL and HA/PCL |
打印出的nano-HA/PCL和micro-HA/PCL复合材料组织工程支架如图 7所示。可以看出，nano-HA/PCL和micro-HA/PCL复合材料组织工程支架均能形成预先设计好的孔隙结构且相互连通。
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图 7 micro-HA/PCL和nano-HA/PCL复合材料组织工程支架外观 Fig.7 The external views of micro-HA/PCL and nano-HA/PCL composite tissue engineering scaffolds |
通过显微镜观察micro-HA/PCL和nano-HA/PCL复合材料组织工程支架的多孔结构，如图 8所示。micro-HA/PCL和nano-HA/PCL复合材料组织工程支架都能形成分布均匀、形状近似矩形的三维孔隙结构，通过JTVMS-1510T型显微镜自带软件测量得到micro-HA/PCL复合材料组织工程支架孔隙长为217 μm，宽为190 μm, nano-HA/PCL复合材料组织工程支架孔隙长为239 μm, 宽为204 μm。micro-HA/PC和nano-HA/PCL复合材料组织工程支架的矩形孔隙长、宽都在100~500 μm范围内，有利于细胞的粘附和增殖，且孔隙之间相互连通有利于营养物质的供给。传统的制备方法如冷冻干燥法、粒子沥滤法、气体发泡法等很难加工得到这种形状规则，分布均匀的孔隙结构，而使用熔体微分FDM 3D打印机能够快速制备预先设计好的三维孔隙结构，并且能实现个性化定制。
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图 8 组织工程支架微孔结构 Fig.8 The micropore structure of the tissue engineering scaffolds |
micro-HA/PCL和nano-HA/PCL组织工程支架断面图如图 9所示。可以看出，部分micro-HA粒子在micro-HA/PCL组织工程支架中发生了团聚，而nano-HA粒子被PCL包裹并均匀地分布在nano-HA/PCL组织工程支架中。
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图 9 组织工程支架断面 Fig.9 The cross-section of the tissue engineering stent |
对1.3节制备的试件进行拉伸和弯曲测试，分别得到3D打印纯PCL, micro-HA/PCL和nano-HA/PCL试件的拉伸强度和弯曲强度，对测得各组试件的数据取平均值，结果如图 10所示。由图 10可知，nano-HA/PCL试件的拉伸强度和弯曲强度最大，分别为23.29 MPa、21.39 MPa，相对于纯PCL试件分别提高了26.0%、33.1%；micro-HA/PCL试件的拉伸强度和弯曲强度分别为20.25 MPa、18.77 MPa, 相对于纯PCL试件分别提高了9.5%、16.8%；nano-HA/PCL试件的拉伸强度和弯曲强度比micro-HA/PCL试件分别高了15.0%和14.0%。该现象的主要原因是：HA的模量远高于PCL，HA微粒在复合材料中呈弥散分布状态，粗糙的HA粒子表面和PCL基体产生摩擦力并形成界面承受部分应力，从而导致HA/PCL复合材料3D打印试件的强度高于纯PCL试件；另外nano-HA在复合材料中分布较为均匀，而micro-HA在复合材料中出现了明显团聚现象，所以nano-HA/PCL试件的拉伸强度和弯曲强度比micro-HA/PCL试件的高。
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图 10 3D打印试件的力学性能测试结果 Fig.10 Mechanical properties of the 3D printed specimen |
支架的孔隙率P是指支架材料中孔隙体积与材料在自然状态下总体积的比值，计算公式为[15]
| $ P = \frac{{{V_0}-V}}{{{V_0}}} \times 100\% = \left( {1-\frac{{{\rho _0}}}{\rho }} \right) \times 100\% $ | (1) |
式中，V0为支架在自然状态下的体积，或称表观体积，cm3；ρ0为材料的体积密度，g/cm3；V为材料的绝对密实体积，cm3；ρ为材料密度，g/cm3或kg/ m3。
经测量nano-HA/PCL支架的外部尺寸为41.64 mm×41.68 mm×3.14 mm，micro-HA/PCL支架的外部尺寸为40.44 mm×40.43 mm×3.04 mm；nano-HA/PCL支架的质量为2.48 g, micro-HA/PCL支架的质量为2.39 g。经计算可得nano-HA/PCL和micro-HA/PCL支架的体积密度(质量与表观体积的比值)分别为0.455 g/cm3和0.481 g/cm3。
| $ \rho = \frac{{{m_1} + {m_2}}}{{{V_1} + {V_2}}} $ | (2) |
式中ρ为复合材料材料的密度；m1，V1为HA的质量和体积；m2，V2为PCL的质量和体积。根据式(2)计算得到HA/PCL复合材料的密度为1.31 g/cm3。根据式(1)计算nano-HA/PCL支架和micro-HA/PCL支架的孔隙率，结果分别为65.27%，63.28%。nano-HA/PCL和micro-HA/PCL组织工程支架中的孔隙结构有利于血管的生长、营养物质的传输并为细胞代谢废物的排出提供了十分有利的环境。与传统盐析法制备的组织工程支架相比，FDM 3D打印组织工程支架具有高度贯通的孔隙结构，更有利于细胞植入生长。
3 结论(1) 通过熔体微分FDM 3D打印机能够打印出nano-HA/PCL和micro-HA/PCL组织工程支架，所制备的组织工程支架具有相互连通且分布均匀的三维多孔结构；采用这种打印方式具有支架加工周期短、成本低、支架强度高的优势。
(2) HA的加入提高了PCL的结晶速率和结晶能力，增强了晶体的完善程度，使得HA/PCL复合材料的结晶峰温度和熔融温度都得到提高。
(3) micro-HA/PCL复合材料组织工程支架孔隙长217 μm，宽190 μm, nano-HA/PCL复合材料组织工程支架孔隙长239 μm, 宽204 μm。这些孔隙结构有利于细胞的粘附、增殖和营养物质的传输。
(4) nano-HA/PCL组织工程支架和micro-HA/PCL组织工程支架均能达到较高孔隙率，分别为65.27%和63.28%，然而由于micro-HA/PCL组织工程支架中HA粒子发生了团聚，从而导致nano-HA/PCL组织工程支架的拉伸强度和弯曲强度均高于micro-HA/PCL组织工程支架，因此，nano-HA/PCL复合材料FDM 3D打印在骨组织工程中更具有潜在的应用前景。
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