手术后粘连是国内外外科手术领域至今尚未解决的重要医学难题之一。通常腹部术后粘连情况最为严重，有研究指出，95%的腹部手术患者会产生粘连[1]。粘连有可能引起严重的并发症，如女性不育、慢性盆腔疼痛、肠梗阻等，甚至可能导致患者死亡[2]。一般来说，手术伤口的愈合过程可以分为伤口止血、炎症反应、细胞增殖以及组织重建4个步骤，因此止血是组织修复的前提[3]。手术过程中造成的创口出血，在经过按压、电凝等物理方法进行止血后，伤口表面经常还会存在弥散性出血(如毛细血管的组织出血等)，很难完全清除干净[4-6]。早在1978年，Ryan等[7]向没有损伤的腹腔中注入新鲜血液，结果发生了大面积的网膜粘连；此外，他们还观察到当腹膜表面受损溢出约2 mL的新鲜血液后，粘连会率先在出血处形成，由此得出血液在粘连形成过程中起到很重要作用的结论。近些年来，研究者们又相继在腹腔手术和妇科手术中印证了血液的存在与粘连的形成存在紧密关系的结论[8-9]。
目前，在伤口与周围组织之间植入可降解物理屏障来预防粘连是最为常用且有效的方法，但还没有一种材料是普适且高效的[10]。Interceed是一种常用的防粘连薄膜，它在植入体内后具有良好的生物相容性和无致病免疫性，操作性好，且能有效预防粘连[11]，但在有血液存在的情况下，该材料反而可能促进感染及粘连的发生，所以在使用Interceed前必须确保清除手术视野中的所有血液[10, 12]。Han等[13-14]报道了聚乳酸-羟基乙酸/聚乳酸-乙二醇嵌段共聚物电纺膜具有良好的操作性，在大鼠体内和小型猪体内可一定程度预防粘连；但同时也发现，在有血液存在的情况下，该电纺膜的防粘连效果要比完全止血情况下差。有些研究者曾试图在手术后直接使用止血药物或者止血材料预防粘连，结果发现绝大部分止血材料非但不能防粘连，反而可能会促进粘连形成；还有些止血材料即使不会促进粘连的产生，对粘连的预防效果也不明显[15]。因此研究同时具有止血和防粘连效果的可降解材料势在必行。斯清庆等[16]曾使用明胶-壳聚糖交联膜分别进行脊柱双侧止血和防硬脑膜粘连的效果评价，发现该交联膜具有明显的止血及防硬脑膜粘连功能，但并未指出该材料能否在出血部位同时具有止血和防粘连作用。在前期的止血防粘连研究中，本课题组发现血块的存在能够促进成纤维细胞在伤口处的大量增殖，因此在有出血时单纯使用防粘连膜预防粘连效果有限；另一方面完全止血在一定程度上虽然可以降低粘连发生率，但是一旦防粘连膜发生移位，仍然会形成强度较高的粘连[17]。
本文旨在制备出一种安全有效的止血防粘连屏障，既可以明显降低粘连发生率，又能够大大降低粘连等级和强度。该止血防粘连屏障由羧甲基淀粉止血海绵与聚乳酸-羟基乙酸/聚乳酸-乙二醇嵌段共聚物静电纺丝防粘连膜复合而成，使用氯化钙和甘油对多孔海绵体的孔隙率和韧性进行调节，并进一步对材料的细胞相容性、体外凝血性能和体内止血性能进行考察。最后，使用大鼠盲肠磨损模型对止血防粘连屏障的有效性进行详细评价。
1 实验部分 1.1 试剂与仪器羧甲基淀粉(CMS)，医药级，黏度大于1 000 mPa·s，安徽山河药用辅料股份有限公司；聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)，医药级，分子量(Mw)60 000 g/mol，n(LA)/n(GA)=75/25，聚(乳酸-乙二醇)共聚物(PLA-b-PEG)，医药级，分子量(Mw)10 000 g/mol，n(LA)/n(EG)=50/50，济南岱罡生物工程有限公司；甘油(GL)、氯化钙和二次水等均为分析纯，北京化学试剂公司。所有试剂使用时均未经进一步纯化。
小鼠成纤维细胞(L929)和大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)购于北京协和细胞资源中心。细胞培养使用DMEM-H培养基(dulbecco's modified eagle's medium，Gibco公司)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，Hyclone)、青/链霉素(PenStrep，Invitrogen)以及胰岛素注射液(江苏万邦)，细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8，CCK-8，日本Dojindo公司)；商业化胶原蛋白止血材料(Collagen)；商业化速即纱止血材料(Surgicel®，强生)。
扫描电子显微镜(SEM)，JSM-6700F，日本JEOL；红外光谱仪，TENSOR 27，德国Bruker公司。
1.2 实验过程 1.2.1 材料制备(1) CMS止血海绵
将0.04 g/mL CMS溶于超纯水中，室温搅拌4 h至均匀溶解。然后边搅拌边向其中缓慢滴加一定量的CaCl2水溶液以避免产生沉淀。随后，在溶液中加入不同比例的甘油(体积分数0~3%)，继续搅拌直至分散完全。将均匀的CMS溶液注于10 cm培养皿后，立即置于-20 ℃或-60 ℃预冷冻24 h或者置于液氮(-196 ℃)中快速预冷冻30 min，再放入冷冻干燥机中-60 ℃条件下冷冻干燥48 h，得到CMS海绵，室温保存于真空干燥箱中。
(2) 止血防粘连屏障
止血防粘连屏障由内层PLGA/PLA-b-PEG电纺膜(EM)和包覆于其外的CMS海绵组成。首先制备电纺膜，配制PLGA/PLA-b-PEG的共混溶液，聚合物质量比为85:15，溶剂为DMF与丙酮(体积比5:5)的混合溶剂，聚合物总质量浓度为0.5 g/mL。静电纺丝装置由10个喷丝头、1个接收滚筒、高压电源和电脑控制的推进装置组成，纺丝温度为室温(25 ℃左右)，湿度50%左右，电压20 kV，推进速率10 μL/min，纺丝时间设定为40 min，所得的纤维膜厚度为(120±10)μm。将所得EM纤维膜置于真空干燥箱中，室温下真空干燥24 h以充分除去残留溶剂。
随后配制CMS溶液。在培养皿中将电纺膜均匀浸泡至CMS溶液中，将该培养皿立即置于-20 ℃预冷冻24 h，再放入冷冻干燥机中-60 ℃条件下冷冻干燥48 h。最终，将所得CMS-EM止血防粘连屏障置于真空干燥箱中室温保存。
1.2.2 止血材料的表征扫描电子显微镜表征将CMS海绵体表面、断面形貌在喷金后使用扫描电子显微镜进行观察。加速电压5 kV，电流10 mA。
孔隙率P测定取一块长方体形状的CMS海绵，其孔隙率的计算公式为[18-19]
| $ P = \left( {\frac{{{V_{\rm{m}}}-{V_{\rm{p}}}}}{{{V_{\rm{m}}}}}} \right) \times 100{\rm{\% = }}\frac{{A \times T-\left( {\frac{m}{{{\rho _{\rm{p}}}}}} \right)}}{{A \times T}} \times 100{\rm{\% }} $ |
其中，Vm和Vp分别是海绵体和粉末所占的体积；m、A和T分别为海绵体的质量、底面积和厚度；ρp为CMS粉末的密度，其值为0.764 g/cm3。
红外光谱分析 使用TENSOR 27红外光谱仪对膜材料进行结构表征，扫描速率4 cm-1，扫描32次，扫描范围4 000~500 cm-1。
1.2.3 材料的细胞相容性评价细胞培养 L929细胞培养液为DMEM-H培养基中添加10%(体积分数，下同)胎牛血清和1%青/链霉素；IEC-6细胞培养液为DMEM-H培养基中添加5%胎牛血清和0.01 mg/mL的胰岛素。培养箱温度设定为37 ℃，培养氛围为含有5% CO2的空气，培养液每两天更换一次。将L929和IEC-6细胞分别接种于96孔板内(1×104细胞/孔)，12 h后，细胞贴壁，将用紫外射线照射2 h杀菌后的CMS海绵(100 μg)置于细胞培养基(100 μL)中，对照组为正常培养的细胞，实验组为加入止血海绵进行培养的细胞，空白组仅有培养液并无细胞。
细胞存活率(cell viability，CV) 使用细胞计数试剂盒(CCK-8)对孔板中活细胞进行计数。细胞培养1 d和4 d后，取出培养基中所有样品，用PBS冲洗后，将含有10% CCK-8的完全培养液加入孔板中，继续在37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h，使用酶标仪在450 nm处测定光密度值(optical density，OD)。细胞存活率的计算公式为[20-21]
| $ C = ({D_{\rm{t}}}-{D_{\rm{b}}})/({D_{\rm{c}}}-{D_{\rm{b}}}) \times 100\% $ |
式中，C为细胞存活率；Dt、Db和Dc分别为实验组、空白组和对照组中所测得的OD值。
1.2.4 体外凝血效果分析定性分析 将CMS海绵体(甘油含量分别为0、2%和3%)裁成约1 cm×1 cm的样品置于培养皿中。在每个样品表面滴加100 μL大鼠血液(含10%柠檬酸钠抗凝剂)，空白对照组(Control)中血液直接滴加到培养皿表面。所有培养皿在37 ℃恒温箱中培养5 min后，向培养皿中缓慢加入50 mL去离子水，此时没有发生凝固的血液将会慢慢溶解，使得去离子水变红。通过直接观察来评价各组海绵体的凝血效果，并对实验过程进行拍照记录。
定量测量 利用血红蛋白测定试剂盒对凝固在材料上的血块进行定量测量，按照试剂盒操作步骤将血块溶解于试剂，将所得溶液稀释至可测量范围内，使用紫外分光光度计测定。该试剂盒的测定原理是利用QuantiChromTM将血红蛋白转变成均匀的有色终产物，用紫外分光光度计在400 nm处进行测量，以得到样品中的血红蛋白浓度。
1.2.5 体内止血性能分析定性分析 通过大鼠盲肠磨损实验对止血防粘连屏障的止血性能进行评价。实验动物由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。所有实验均按照科技部颁布的《实验动物管理条例》的相关规定进行。SD大鼠，体重240~260 g，每只大鼠用10%水合氯醛按4 mL/kg进行腹腔注射麻醉，沿腹壁中线切开，露出盲肠，盲肠磨损面积约为2 cm×2 cm。大鼠随机分成4组，每组10只，分别进行以下操作：(ⅰ)空白对照组，不使用止血材料；(ⅱ)在磨损伤口覆盖大小为3 cm×3 cm的胶原蛋白产品(Collagen)；(ⅲ)在磨损伤口覆盖大小为3 cm×3 cm的速即纱(Surgicel®)；(ⅳ)在磨损伤口覆盖大小为3 cm×3 cm的CMS止血海绵。所有大鼠伤口用生理盐水润湿的纱布覆盖来模拟正常的腹腔环境。5 min后，轻轻去除覆膜，通过直接观察评价止血效果，并对盲肠表面血块和微出血情况进行拍照记录。
定量测量 利用血红蛋白测定试剂盒对30 min内伤口的出血量进行定量测量。收集盲肠表面和材料上的血块，按照试剂盒操作步骤将血块溶解于试剂，将所得溶液稀释至可测量范围内后，使用紫外分光光度计在400 nm波长处进行测定，得到样品中血红蛋白浓度。
1.2.6 体内防粘连效果评价利用大鼠盲肠磨损模型对止血防粘连屏障的体内防粘连效果进行评价。实验动物由中国科学院过程工程研究所动物实验室提供，并饲养于温度、通风可控的标准化消毒动物室。为让动物适应环境，实验开始前至少1周不进行任何处理。所有动物实验由中国科学院过程工程研究所动物实验室的动物护理和使用委员会批准进行。SD大鼠，体重320~350 g，每只大鼠用10%水合氯醛按4 mL/kg进行腹腔注射麻醉，沿腹壁中线切开，露出盲肠，盲肠磨损面积约为2 cm×2 cm，右侧对应腹壁切口面积为2 cm×2 cm。大鼠随机分成5组，分别进行以下操作：(ⅰ)正常组，10只，不进行任何手术处理；(ⅱ)对照组，15只，进行手术并使用生理盐水冲洗伤口；(ⅲ)CMS组，15只，在磨损伤口与腹壁切口之间覆盖大小为3 cm×3 cm的甘油含量为1%的CMS海绵；(ⅳ)EM组，30只，在磨损伤口与腹壁切口之间覆盖大小为3 cm×3 cm的EM；(ⅴ)CMS-EM组，30只，在磨损伤口与腹壁切口之间覆盖大小为3 cm×3 cm的CMS-EM止血防粘连屏障。手术10天后，所有大鼠处死，观察腹腔粘连情况并拍照记录，各组结果分别进行粘连等级、粘连强度和发生率统计。粘连等级及强度的计算公式为[17]
| $ \bar S = \sum\limits_{s = 0}^3 {(s \times {a_s})} /\sum\limits_{s = 0}^3 {{a_s}} $ |
式中：S为粘连等级(或强度)的平均值，s为粘连等级，as为发生粘连等级为s的大鼠的数量。粘连等级的评价制度为：0=无粘连；1=粘连呈现丝状结构；2=粘连呈现切片结构或者存在广域粘连；3=粘连面积广，粘附到腹壁或者相邻的内脏器官。粘连强度的评价制度为：0=无粘连；1=轻度粘连，重力可使其分离；2=中度粘连，可钝器分离；3=致密粘连，需要锐性解剖剥离[22-24]。
组织学观察 将盲肠组织固定于10%福尔马林中过夜，使用一系列梯度的乙醇溶液进行脱水处理，最后包埋于石蜡中。将组织切片进行HE染色并观察。
1.2.7 统计分析体内粘连结果使用Fisher精确检验法，对实验组和对照组进行比较，比较内容包括动物的粘连发生率和粘连等级。P＜0.05被认为具有显著差异，P＜0.01被认为具有极显著差异。其他结果均以平均值±标准偏差(SD)表示。用Student's t-检验计算各组间的统计学差异，P＜0.05被认为是具有显著差异，P＜0.01被认为是具有极显著差异。
2 结果与讨论 2.1 止血海绵形貌的影响因素 2.1.1 预冷冻温度冷冻干燥后的样品基本保持冻结时内部结构的特点，在预冷冻过程中能够锁住聚合物结构，干燥后即可获得多孔材料。因此，预冷冻过程中的高分子材料相分离与结晶结构是影响海绵体孔隙形态的主要因素。实验中选取-196 ℃、-60 ℃和-20 ℃ 3个预冷冻温度来观察其对海绵体表面结构和断面结构的影响，如图 1所示。可以看出，与普通低温(-20 ℃和-60 ℃)慢速预冷冻24 h得到的海绵体相比，液氮中(-196 ℃)快速预冷冻30 min得到的海绵体孔洞尺寸更小，而且孔洞呈现垂直分布，孔洞之间的横向联结较少，壁厚也变薄，因而材料更易碎，可操作性较差。不同预冷冻温度对应的CMS海绵孔隙率示于表 1。可以看出，海绵体的孔隙率随着预冷冻温度的升高有增加的趋势，与SEM形貌观察结果相对应。
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图 1 对应于不同预冷冻温度的CMS海绵体的表面及断面SEM形貌 Fig.1 Surface and cross-section SEM micrographs of CMS sponge with different freezing temperatures |
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下载CSV 表 1 对应于不同预冷冻温度的CMS海绵体的孔隙率(n=5) Table 1 Porosity of CMS sponge with different freezing temperatures (n=5) |
这种现象可能与预冷冻过程中水的结晶以及水与CMS聚合物发生宏观相分离有很大关系。CMS溶液于-196 ℃下快速预冷冻，在相分离发生过程中水迅速形成大量结晶，阻碍了相分离的继续进行，CMS发生聚集的时间较短，所以孔洞壁厚较薄；同时因为预冷冻速率越快，冰晶生长时间越短，所形成的冰晶越小，因而得到更细小的孔洞。另一方面，CMS溶液在-20 ℃预冷冻的过程中，水与聚合物发生相分离的时间较长，冰晶生长速度较慢，CMS有较长的时间发生聚集，所以孔洞的壁厚较厚；同时冰晶的生长时间也较长，能够形成较大冰晶，因而孔洞较大，孔隙率也较高，继而导致海绵体更为疏松。综上可知，预冷冻温度升高时，海绵体内部孔洞之间的横向连接更加明显，材料的韧性提高，同时孔隙率更大，比表面积较高。由此选择-20 ℃预冷冻24 h作为CMS海绵体的预冷冻条件。
2.1.2 甘油含量载有0、1%、2%和3%甘油的CMS海绵的宏观形貌如图 2(a)~(d)所示。研究发现甘油含量为0和1%的海绵呈脆性，极容易破损；而甘油含量为2%和3%的海绵柔软且具有韧性，操作性好。
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图 2 不同甘油含量CMS海绵体的样品照片、表面和断面SEM形貌 Fig.2 Photo images, surface micrographs and cross-section micrographs of CMS sponge with various ratios of glycerol |
图 2(e)~(l)为载有不同含量甘油海绵的表面和断面结构形貌。可以看出，甘油含量为0和1%的CMS海绵孔洞壁较薄，甘油含量为2%的CMS海绵孔洞壁较厚，载有3%甘油的CMS海绵的多孔结构已遭到破坏，孔洞的尺寸明显不均匀。因此可得出，随着甘油含量的增加海绵体的孔洞壁变厚，继续增加甘油含量，可能会破坏海绵体孔洞的均匀性。
另外，对CMS海绵体材料的孔隙率进行测量与计算后发现，随着甘油含量的增加，海绵的孔隙率明显降低(表 2)，与形貌观察结果一致。这可能是因为甘油作为一种有效的冷冻保护剂能够与水良好结合，在预冷冻过程中，甘油含量的增加加速了水从CMS聚合物中发生相分离，CMS能够更快速地发生聚集，水也能够形成更大的冰晶，从而冷冻干燥后得到的海绵体孔洞也更大，孔洞壁更厚。同时在海绵体中，甘油能够吸收水分并阻止水分的挥发，这会导致海绵体孔洞易因为吸收空气中的水分而发生塌缩，继而孔隙率降低。
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下载CSV 表 2 对应于不同甘油含量的CMS海绵体的孔隙率平均值(n=5) Table 2 Mean porosity of CMS sponge with different ratios of glycerol(n=5) |
图 3为止血防粘连屏障的断面形貌，可以看出，两层CMS海绵体紧紧贴附于中间的电纺膜，形成类似“三明治”结构。由此可见，海绵层在被完全溶解之前能够一直包覆着电纺膜。
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图 3 CMS-EM止血防粘连膜的断面形貌 Fig.3 Cross-section micrograph of the CMS-EM barrier |
将CMS-EM止血防粘连屏障浸于PBS中孵育1 h，并将孵育后的止血防粘连屏障(CMS-EM-1h)、止血防粘连屏障(CMS-EM)与电纺膜(EM)进行表面红外光谱对比分析，结果如图 4。可以看出，CMS-EM-1h与EM的表面红外光谱图基本可以重合，而与CMS-EM的表面红外谱图有明显区别，说明孵育后CMS-EM表面的海绵体已经完全溶解。综上可知，在PBS中CMS的溶解时间约为1 h。由于腹腔中器官之间的腹腔液的量要比体外实验中PBS的量少，因此可以粗略推断CMS海绵体在腹腔中的溶解时间为1~2 h，对于止血过程已经足够长。
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图 4 PBS中孵育1 h前后的CMS-EM止血防粘连膜以及电纺屏障EM的表面红外谱图 Fig.4 Surface FT-IR of EM and CMS-EM barriers before and after incubation in PBS for 1 hour |
图 5显示的是CMS海绵在5 min内的凝血过程。使用超纯水冲洗后，对照组(Control)中的冲洗液迅速变为红色，这说明加入抗凝剂后的血液在培养皿表面不能发生自主凝血。而在CMS海绵体上，血液几乎都凝结成血块，含3%甘油的CMS海绵体的冲洗液发生微弱变化，其他材料组的冲洗液基本保持无色透明。由此可知，CMS海绵体能够在短时间内迅速促进血液凝固，而甘油的加入对于材料的凝血性能没有明显影响。从冲洗之后的图片也可以看出，对于2%甘油含量的CMS海绵体来说，在凝血后，血块完全依附于海绵体，当使用外力将CMS海绵体撕裂并使之在水中浮动时，血块也相应地随着材料移动而移动，说明血液凝固成血块之后仍然会依附于海绵体，而不会重新溶解或者分散。
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图 5 不同甘油含量的CMS海绵的体外凝血过程 Fig.5 Photo images during the blood-clotting process of CMS sponge with different ratios of glycerol |
利用QuantiChromTM血红蛋白试剂盒对CMS海绵的凝血性能进行定量评价, 图 6显示了不同甘油含量的CMS海绵体上的血红蛋白浓度。其中，将100 μL含有抗凝剂的血液中的血红蛋白总浓度设为参考值，样品中血红蛋白浓度越高说明血块凝固的越完全。结果显示，CMS样品上血红蛋白的浓度都很高，同样印证了CMS海绵具有良好的凝血效果，这可能是由于淀粉材料本身具有一定的吸湿性，能够更快地吸收血液中的水分，促进血液中凝血因子的聚集而发生凝血。空白对照组的血红蛋白浓度近似为0，证实了在培养皿上的血液不能在5 min内自主凝固。甘油含量为0和2%的CMS海绵体中的血红蛋白浓度与100 μL血液中的血红蛋白浓度几乎相同，甘油含量为3%的CMS海绵样品上的血红蛋白浓度稍低于前两组材料，但无统计学显著差异，这可能与甘油的加入降低了海绵体的孔隙率有关。
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图 6 不同甘油含量的CMS海绵上血红蛋白含量平均值(n=5，#表示实验组与对照组存在极显著差异，P < 0.01) Fig.6 The concentration of the hemoglobin in blood clots on CMS sponge with different ratios of glycerol (n=5, # indicates extremely significant difference from the control group, P < 0.01) |
考虑到增加甘油含量会提高海绵体的韧性，但同时降低孔隙率和凝血性能，所以需要控制CMS海绵中甘油的含量使其具有更好的实用性，由此选定2%甘油含量的CMS海绵体作为动物体内实验的样品。
2.4 材料细胞相容性评价无细胞毒性是生物材料应用的前提与保证。使用成纤维细胞(L929)和上皮细胞(IEC-6)对2%甘油含量的CMS海绵体进行了细胞相容性评价，细胞在对照组中的存活率设定为100%。如图 7所示，CMS海绵体的加入对于两种细胞的生长有相似的影响，细胞存活率接近甚至超过100%。这意味着所有使用的材料都没有细胞毒性，并且适合于之后的研究。
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图 7 CMS海绵在培养1 d和4 d后的细胞存活率 Fig.7 Cell viability of CMS sponge after 1 day and 4 days |
图 8为对照组、Collagen、Surgicel®和CMS海绵进行体内伤口止血处理5min的过程及结果。从结果可以看出，未使用材料处理的伤口在5 min后仍保持活动性出血，说明在无外界干扰条件下此实验模型中的大鼠伤口处于出血状态。选择Collagen和Surgicel®两种商业产品作为对照，可以看出，Collagen覆盖于磨损伤口上时，伤口出血渗透胶原蛋白，而且伤口在处理5 min之后并没有完全止血；在经过Surgicel®处理5 min后，伤口只剩较少出血点，而且伤口表面有黑色血痂。在CMS海绵体组中，伤口的血液在5 min时都已凝固，CMS在吸收血液后产生黏性，紧附于伤口处难以撕下，产生物理压迫作用，更有利于抑制出血。
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图 8 对照组、Collagen、Surgicel®和CMS海绵进行体内伤口止血处理5 min的过程及结果 Fig.8 Photo images of rats' cecum taken during the process of hemostasis: the abraded cecum was covered by saline soaked gauze (Control), Collagen, Surgicel®, and CMS sandwiched barrier for 5 min |
为了更加直观地比较各种材料的止血性能，利用QuantiChromTM血红蛋白试剂盒对材料处理30 min后的伤口出血量进行定量测量，样品的血红蛋白浓度正比于出血量。
如图 9所示，所有实验组的出血量都比对照组要低，商业化胶原蛋白的伤口出血量较高。使用CMS海绵体处理的伤口出血量最低，表现出与Surgicel®类似的止血效果，说明该材料具有很好的体内止血性能。可以推断CMS海绵的凝血性能不仅与其结构的多孔性有关，也与它所携带的众多羟基和羧基有重要关系。CMS能够与Ca2+螯合，促进线性分子转化为网格结构[25]，而Ca2+又能够刺激血小板以及Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ凝血因子来促进凝血[26-27]。因此，当使用CMS海绵体对伤口进行处理时，该材料可以从血液中吸收水分，浓缩凝血因子从而促进止血。这使得CMS海绵体成为一种既可以释放凝血因子又可以促进动物体凝血因子聚集的止血材料。另外，由于具有良好的吸水性和较快的吸水速率，CMS海绵体在吸收血液中的水后能够牢固地粘附于伤口上，产生物理压迫作用，从而更迅速地止血。
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图 9 体内止血30 min后各组出血中的血红蛋白浓度平均值(n=10，*表示实验组与对照组存在极显著差异，P < 0.05) Fig.9 The concentration of the hemoglobin in blood and blood clots gathered from the abraded cecum and materials after 30 min(n=10, * indicates significant difference from the control group, P < 0.05) |
手术10 d后，使用不同材料处理的大鼠体内发生粘连的状况不尽相同。对各组材料处理后的粘连等级和粘连强度进行统计分析，结果示于表 3。可见同一材料组中的粘连等级和粘连强度具有类似的结果。可以看出，在对照组中，有100%的大鼠发生了术后粘连，平均粘连等级为2.53。CMS海绵处理的大鼠也发生了较高的粘连率(93%)和粘连等级(2.2)，这说明CMS海绵在单独使用时的防粘连效果较差。这是由于粘连一般开始形成于术后的第3~5天，而CMS海绵体在腹腔中会于2 h内慢慢溶胀溶解，因此CMS海绵只起到止血作用，而并不能阻止粘连的形成。相对于对照组，EM组和CMS-EM组中大鼠都显示了良好的防粘连效果(P < 0.01)。其中，使用EM处理的大鼠粘连发生率为40%，粘连等级(0.87)和粘连强度(0.73)也明显降低。相较而言，CMS-EM止血防粘连屏障的效果更佳，粘连发生率仅为26%，粘连等级和粘连强度也分别降低至0.4和0.3。这说明EM单独使用时能够在一定程度上减少粘连的形成，而止血海绵层的引入使得防粘连效果更加有效。
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下载CSV 表 3 大鼠盲肠磨损处理10 d后粘连等级、强度和发生率 Table 3 Adhesion level, tenacity and incidence in rats after 10 days |
与此同时，对手术后的盲肠进行详细的观察以及组织切片病理分析，结果如图 10所示。很明显，组织学观察的结果与粘连观察结果是一致的。使用没有创伤的盲肠作为正常参考。对于对照组和CMS组来说，绝大部分大鼠体内都发生了严重的粘连。原有的盲肠结构消失，上皮变性坏死脱落，盲肠的平滑肌层与腹壁的肌肉层几乎融合在一起，形成了严重的粘连。在使用EM处理的大鼠体内盲肠黏膜上皮保持完整，上皮细胞虽呈高柱状排列，但有较多肉芽组织形成，而且可以观察到盲肠与肠系膜的微弱粘连。在用CMS-EM止血防粘连屏障处理后的大鼠体内较少形成高强度粘连，盲肠的上皮细胞呈现正常状态，盲肠部位没有发现明显粘连，而且观察到靠近膜位置的肉芽组织慢慢发展为瘢痕组织。在植入CMS-EM材料10 d后电纺膜大多仍然留在原位，且紧密地粘附包裹于伤口处。这可能是因为CMS在止血过程中粘附于伤口上，附着力较强，止血效果优异，出血量少；而且材料本身在止血后很快就被溶解吸收，因而不会造成材料的移位，带来更好的防粘连效果。
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CE—盲肠上皮；SM—平滑肌；AW—腹壁；GT—肉芽组织；ST—瘢痕组织。 图 10 大鼠盲肠磨损处理10 d后的结果对比 Fig.10 Adhesion formation after 10 days in rats treated with various materials after surgery |
(1) 采用羧甲基淀粉为主要原料制备出具有良好止血效果的海绵体，并将其与PLGA/PLA-b-PEG防粘连膜结合，得到高性能止血防粘连屏障。CMS海绵体与电纺膜紧密贴合，形成牢固的“三明治”结构。
(2) 预冷冻过程中水与聚合物发生宏观相分离，不同甘油含量和预冷冻温度都对海绵体孔隙大小及孔隙率产生影响，由此优选出2%为CMS海绵体的最佳甘油含量，-20 ℃预冷冻24 h为冷冻干燥的最佳条件。
(3) CMS海绵在体内止血速率快、出血量低，能够达到与商业化的Surgicel®类似的优异止血效果。此外，CMS海绵止血后形成具有黏性的凝胶，能够促进电纺膜紧密贴附于伤口不发生移位；相较于单独使用EM电纺膜，CMS-EM止血防粘连屏障大大降低了粘连等级、强度和发生率，能够更好地预防粘连形成。
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