近年来，我国沿海大部分地域频发贝类毒素中毒事件，不仅带来十分严峻的食品安全问题，还给沿海地区的水产加工业带来严重损失。因此，贝类毒素的检验排查成为众多学者争相研究的热点问题。贝类毒素主要包括麻痹性贝类毒素(PSP)、腹泻性贝类毒素(DSP)、健忘性贝类毒素(ASP)以及神经性贝类毒素(NSP)4种^[1]。其中PSP是贝类毒素中毒性很强的一类，对人体的毒害极强^[2]。石房蛤毒素(STX)为PSP的代表性毒素，占PSP毒素总量的85%左右^[3-4]。联合国卫生组织规定每100 g贝类可食部分PSP限量为80 μg ^[5]。目前检测PSP的方法主要有小鼠生物法^[6]、高效液相色谱法(HPLC)^[7]和免疫学检测方法即酶联免疫吸附法(ELISA)^[8]。小鼠生物法操作简单，但是误差较大，重复性差；HPLC测定毒素成分和种类最为准确，然而样品纯度要求高，前处理较繁琐且仪器昂贵；ELISA抗原-抗体检测法特异性高，但是检测时间较长，试剂消耗量也较大^[4]。因此，常用的传统方法已不能满足商品质量安全符合性检验的需求。近年来微流体技术的出现为麻痹性贝类毒素的检测提供了新的思路。微流体技术是指在微观尺寸下进行控制以及操作流体的技术，又称芯片实验室(lab on a chip), 其应用涉及了生物大分子分析、生物医学诊断以及环境监测等方面，在化学和生命科学等领域引起了众多学者的重视^[9-11]。本文以STX为研究对象，将微流体芯片技术与免疫分析方法相结合，借助微流体芯片平台，采用非均相免疫分析^[12]，以羧基聚苯乙烯高分子微球为固相载体，在微球表面连接抗体蛋白^[13]进行STX的免疫分析检测，探索了贝类毒素检测的新方法。

整个微流体检测系统主要由微流体微型注射泵(PHD22/2000型，美国Harvard公司)、注射器(250 μL，瑞士Hamilto公司)、光电倍增管(PMT，R1924 A-20，滨松电子)、玻璃芯片、三通阀、暗盒等设备通过直径为500 μm的毛细管连接。其中注射器的尺寸需要和微型注射泵的设置一致，以保证实验过程中各流体的体积能够准确控制^[14-15]。本文采用的微流体芯片是尺寸为200 μm×200 μm的方形芯片，芯片内的微管道呈树枝状结构，如图 1所示。其中，a端与一个三通阀相连，进行取样、进样等操作，三通阀用于控制流体方向；微球由b端导入，之后处于封闭状态；c端是废液口，实验过程中的反应液及洗涤液均由此排出；d处为微坝，其控制的流路缝隙为20 μm，由于所使用的微球粒径为45 μm，故羧基聚苯乙烯微球会被阻挡在微坝处进行反应；e处连接了光电倍增管，对反应产生的光信号进行放大，光电倍增管连接电脑进行数据的读取^[16]。实验结束后，洗出微球，并对全流路进行清洗，然后根据得到的信号响应值进行定性定量分析。

图 1(Fig. 1)

图 1 微流体装置示意图 Fig.1 Schematic diagram of the microfluidic device

本文微流体检测系统采用化学发光检测方法。鲁米诺在碱性环境中可被许多氧化剂氧化而发光，其中过氧化氢最为常用，但鲁米诺氧化发光的反应速度较慢, 某些酶类或无机催化剂可以加速鲁米诺的化学反应速度，如辣根过氧化物酶(HRP)^[17]。辣根过氧化物酶首先与过氧化氢反应形成氧化态的HRP(HRP-Ⅰ)，HRP-Ⅰ与鲁米诺阴离子反应生成半还原态的酶HRP-Ⅱ和鲁米诺自由基。此半还原态的HRP-Ⅱ可以继续被第二个鲁米诺分子还原至原状态。反应体系中鲁米诺吸收了反应中释放的能量而由基态跃迁至激发态，从激发态返回至基态时将能量以光辐射的方式释放出来，从而产生发光现象^[18]。

2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，牛血清白蛋白(BSA)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，美国Sigma-Aldrich公司；Proclin 300，美国Supelco公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC，99%)，西亚试剂；鲁米诺(97%)，美国Sigma-Aldrich公司；氢氧化钾(KOH)，氯化钠(NaCl)，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，十二水合磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，氯化钾(KCl)，过氧化氢(30%)，以上试剂均为分析纯，北京化工厂。吐温-20(Tween-20)，化学纯，西陇化工股份有限公司。45 μm羧基聚苯乙烯羧基微球(1.45×10⁶ mL^-1)，苏州纳微生物科技有限公司；麻痹性贝类毒素试剂盒，美国Beacon公司；羊抗兔IgG抗体(1.0 mg)，上海斯信生物科技有限公司。

pH计，PH S-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司；电子天平，B T-25S型，德国赛多利斯科学仪器公司；旋转培养器，Q B-228型，震荡器，VORTE X-6型，海门市其林贝尔仪器制造公司；高速冷冻离心机，3K15型，德国Sigma公司。

将微球溶液、反应缓冲液和洗涤液放置至室温(20 ℃左右)，量取172.4 μL微球溶液置于1.5 mL低蛋白吸附离心管中，将其放在离心机中离心10 min，离心机转速为4000 r/min，离心结束后除去上清液；然后向剩余的沉淀物中加入400 μL已配好的缓冲液，离心10 min并除去上清液；再次向沉淀物中加入170 μL的缓冲液，同时配制200 mg/mL的EDAC溶液，量取20 μL EDAC溶液于离心管中，在振荡器上震荡混匀15 min；然后向离心管中加入100 μL的2 mg/mL的羊抗兔IgG抗体(二抗抗体)溶液，震荡混匀，再将离心管放至旋转培养器，混匀反应1 h，结束后离心10 min并除去上清液；用400 μL洗涤液重悬微球，再次离心分离除去上清液，加入400 μL洗涤液将包被好的微球溶液放至-20 ℃冰箱中保存备用。

对包被好的微球进行简单的定性分析，将空白羧基聚苯乙烯微球和共价连接了IgG抗体的微球在不加竞争抗原的情况下利用直接竞争酶联免疫的方法^[19-20]分别进行检测，采集50个数据点，对两者的信号强度进行对比。

将包被好抗体的微球导入至芯片中，并清洗多余微球；分别取STX抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的STX抗原20 μL于离心管中混合20 min，从进样口导入至芯片中进行反应；从进样口导入相同体积的底物溶液，分别设置流速为0.01、0.02、0.03、0.05、0.07、0.10 mL/min进行测试，得到不同流速下的发光信号强度。

将包被了羊抗兔IgG抗体的微球导入至芯片中，并清洗多余微球；分别取试剂盒中系列梯度浓度的标准品(分别为0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 ng/mL)，HRP标记的STX抗原和STX抗体15 μL于离心管中混合20 min，从进样口导入芯片中进行反应；然后用200 μL缓冲液清洗，共2次；从进样口导入30 μL底物溶液，进样10 μL左右用光电倍增管检测发光信号强度。

首先对样品进行前处理，将贝壳去除取出贝肉，将贝肉样品均质。然后称取1 g均质好的样品于50 mL离心管中，并加入10 mL 0.1 mol/L盐酸，剧烈震荡混合，在沸水浴中加热5 min。待样品冷却后，于3000 r/min室温离心5 min；取上清液100 μL至2.4 mL样品稀释液中，剧烈振荡混合；取稀释后的贝肉样品进行测定。将稀释250倍的各样品分别放至微流体平台上进行检测，检测结果带入标准曲线的拟合方程，得到对应于每一个样品的PSP浓度，并与限量标准作对比。

图 2为空白微球和包被IgG抗体微球在不加竞争抗原的情况下，分别在微流体-化学发光检测平台上进行检测后得到的信号强度对比图。由图可知，包被了抗体的微球的检测信号值集中在高强度信号区域，并且数据之间相差不大，而空白微球的信号值都低于200000，明显低于包被了抗体的微球，说明IgG抗体成功包被在微球上，可以用于进行后续实验。

图 2(Fig. 2)

图 2 微球表面包被上IgG的确证分析 Fig.2 The confirmatory analysis of IgG on the surface of the microspheres

以鲁米诺-H₂O₂试剂作为底物溶液，由于检测过程的流体是动态的，同时还必须满足酶与底物能够充分反应的要求，所以底物流速的选择是一个关键因素。本文设置了6个不同的底物流速，按照相应的酶联免疫方法，在只改变流速的情况下得出各流速所对应的检测信号强度，结果如图 3所示。

图 3(Fig. 3)

图 3 底物流速分析 Fig.3 Velocity analysis of the substrate

由图 3可知，当底物流速小于0.03 mL/min时，光信号强度随着流速的增大而增大，并且增幅明显；当底物流速大于0.03 mL/min时，光信号随着流速的增加而缓慢下降。从中可以得出，在底物流速为0.03 mL/min时，体系中的酶与底物能够充分反应，达到最大发光强度。

本文采用的检测原理与传统的直接竞争法基本相同，主要区别在于：传统的ELISA方法是将抗体吸附在酶标板表面，而本文方法则是将抗体固定于羧基聚苯乙烯微球的表面。目前常用反应以非均相反应为主，通过对液相体系的不断更换与洗涤，将检测物固定于所选定的界面上，通过酶催化底物发光来得到检测值，从而进行定性定量分析。根据试剂盒中提供的STX标准品，对其进行稀释分别得到质量浓度为0.04、0.06、0.08、0.12、0.24、0.32 ng/mL的标准样，在微流体芯片内进行反应。然后以lgY为纵坐标(Y为抑制率)，标准品质量浓度为横坐标，绘制出标准曲线如图 4所示。

图 4(Fig. 4)

图 4 STX标准曲线 Fig.4 STX standard curve

由图可见，在0.06~0.32 ng/mL范围内曲线具有良好的线性，且线性范围较广。线性拟合后得到的方程为y=0.7876x-0.456，相关系数R²=0.9294。将3倍的空白样品的标准差带入方程计算得到检测限为0.005675 ng/mL。值得一提的是，微流体系统由于非常灵敏而极易受到周围环境的干扰。本文实验采取化学发光的检测方法，虽然是在暗盒中进行，环境光以及实验室外部条件对于检测信号的影响是不可避免的，另外不同批次的样品由于检测时段的差异而受不同程度的影响。因此，此方法测得的标准曲线的线性程度比现有的成熟方法的要低^[21]。

将进行了前处理的贝肉样品稀释250倍于微流体平台进行检测，根据联合国卫生组织规定每100 g贝类可食部分的PSP限量为80 μg，本文匀浆液的质量浓度为0.1 g/mL，经过换算得到PSP标准限量相当于80 ng/mL。通过线性拟合方程计算出最终样品PSP含量并与贝类食品中PSP的限量标准做对比，评估其安全性。表 1所示为各样品的测定结果。由表中数据可知，市场所售的样品中PSP的含量均低于限量标准，为安全食品对人体无害。

表 1(Table 1

表 1 样品测定数据表 Table 1 Sample assay data 样品 ρ计算/ng·mL-1 ρ最终/ng·mL-1 判断结果 1 0.2068 51.6888 合格 2 0.3130 78.2623 合格 3 0.3094 77.3627 合格

下载CSV 表 1 样品测定数据表 Table 1 Sample assay data

本文通过羧基聚苯乙烯微球与抗体的共价连接，将IgG抗体包被在微球表面，并以此作为固相载体在微流体芯片中形成免疫分析柱，用样品流经免疫分析柱的形式代替了传统免疫吸附中试剂及洗涤剂的添加。本文实验条件下最佳的底物流速为0.03 mL/min；由STX标准曲线计算出的检测限为0.005675 ng/mL，而利用传统的ELISA法通过相同试剂绘制出的标准曲线的检测限仅为5 ng/mL。微流体免疫检测方法的抗原抗体试剂用量由传统方法的50 μL减少为15 μL，检测时间由3 h缩短为30 min，大大节约了试剂用量和检测时间。

本实验的不足之处在于只能检测单批次的样品，由于微流体芯片本身的限制，每次实验只能形成一个免疫分析柱。在本文研究的基础上，可以将微流体芯片进行进一步优化，将其设计成多通路以使多个样品反应体系同时进行，实现高通量检测；并且通过改良微量进样装置，可以精确控制反应体系与试剂消耗量，从而进一步优化和稳定实验条件。针对麻痹性贝类毒素的定性以及定量检测方法的研究，也为其他海洋生物毒素的检测研究提供了新的研究思路和研究方法。此外，如今真菌毒素中毒现象愈演愈烈，针对微流体免疫芯片-化学发光技术的研究也对同样为小分子物质的真菌毒素检测有借鉴意义。