口服类剂型具有方便、安全、可实现局部或全身治疗等优点，然而约70%的药物活性组分具有水难溶性，很大程度上限制了这些药物在口服制剂上的应用[1-2]。白藜芦醇(RES)是一种天然的肿瘤化学预防剂，可从诸多天然植物中提取、分离得到[3]。白藜芦醇作为一种植物性抗毒素，具有抗氧化活性，可以预防癌症、心脑血管类疾病等，但由于其水溶性差、不易被人体吸收、生物利用度低，难以达到治疗效果，而将其制备成为纳米分散体可以有效改善药物的水溶性能，进而提高药物的溶出速率、累积溶出量、生物利用度及口服疗效。
纳米药物分散体由纳米药物颗粒及稳定剂组成，制备方法包括介质研磨[4-5]、高压均质法[6]和液相沉淀法[7]等，其中液相沉淀法中应用最为广泛的是反溶剂沉淀法，由该方法所得纳米药物具有颗粒均一、形貌优、尺寸小等特点。反溶剂沉淀法制备药物纳米分散体是一个快速反应过程，而快速反应过程中药物颗粒尺寸的可控制备与反应器的微观混合性能直接相关，反应器的微观混合性能直接影响小尺寸药物颗粒的生成。微通道反应器具有微观混合性能好、放大效应小、操作简便、时间成本低、费用成本低等优点[8]，可实现纳米药物颗粒的可控制备[9-10]。本文利用微通道反溶剂沉淀法优化工艺条件制备了粒径较小的RES纳米分散体，有效提高了RES的体外溶出性能，并利用套管式微通道反应器进行工艺放大，显著提高了处理量。
1 实验部分 1.1 实验原料和仪器 1.1.1 实验原料白藜芦醇，98%，十二烷基硫酸钠(SDS)，95%，天津希恩思生化科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，优级纯，国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2 实验仪器T型微通道反应器，中科院大连物理化学研究所；套管式微通道反应器，自制；喷雾干燥器，德国BUCH；XRD-6000型X射线衍射仪，UV-2600紫外可见分光光度计，日本Shimadzu公司；RC8MD型智能溶出仪，天大天发科技有限公司；ZS90激光粒度仪(DLS)，英国Malvern；8700傅里叶红外光谱仪，美国Nicolet公司；DSC204F1型差示扫描量热仪(DSC)，德国Netzsch公司。
1.2 实验方法 1.2.1 T型微通道反应器制备RES纳米分散体图 1为采用T型微通道反应器示意图。称取一定量的原料药、PVP和SDS，将原料药溶于乙醇或丙酮中，辅料PVP和SDS溶解于实验室自制去离子水中(反溶剂水溶液)，利用平流泵调节药物溶液与PVP和SDS辅料溶液的进料条件，待体系稳定后，在T型微通道反应器出口处收集药物纳米分散体浆料。
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图 1 T型微通道反应器制备药物纳米分散体示意图 Fig.1 Schematic of the preparation of the drug nanodispersion using a T-junction microchannel reactor |
将T型微通道反应器制得的药物纳米分散体浆料置于磁力搅拌器上，在低速、均匀搅拌环境下，调节喷雾干燥参数为：加热温度140 ℃，抽气速率100%，空气流量40 mm，蠕动泵进料量30%。蠕动泵可使浆料匀速进入喷雾干燥器内部，一定时间后，收集药物纳米分散体固体粉末。
1.2.2 套管式微通道反应器制备RES纳米分散体图 2为套管式微通道反应器示意图。称取原料药和辅料，将原料药物溶于乙醇或丙酮中，辅料PVP和SDS溶解于实验室自制去离子水中。利用蠕动泵调节药物溶液与辅料溶液的进料速度，药物溶液为外管进料，辅料溶液为内管进料。待体系稳定后，在出口处收集药物纳米分散体浆料。之后采用1.2.1节T型微通道反应器浆料干燥方法制得RES纳米分散体。
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图 2 套管式微通道反应器 Fig.2 Schematic of the tube-in-tube microchannel reactor |
将RES纳米分散体分散在水中，超声使之分散均匀，取部分样品在633 nm He-Ne, 289.15 K的条件下利用DLS测定平均粒径。
1.3.2 结构与晶型测定利用傅里叶红外光谱仪，KBr压片，在400~4000 cm-1范围内扫描测定原料药、辅料及药物纳米分散体的FT-IR谱图，表征纳米分散体结构。
利用X射线衍射仪，以10(°)/min的扫描速度在10°~50°范围内测定原料药、辅料及药物纳米分散体的XRD谱图，分析纳米分散体的晶型。
利用差示扫描量热仪，在40~400 ℃、10 ℃/min、N2条件下对原料药、辅料及药物纳米分散体进行DSC分析。
1.3.3 接触角测定分别称取相同质量的药物粉末和药物纳米分散体固体粉末置于压片模具内，将模具放入压片机，固定相同压片参数为压力10 MPa、压片时长60 s，压片结束后取出。将压片置于载玻片上，在压片上滴加体积相同的去离子水，利用接触角仪测定压片与去离子水的接触角。
1.3.4 载药量和载药率测定精确称取一定量的RES标准品，溶于二甲基亚砜(DMSO)配制成不同浓度的标准液，利用紫外可见分光光度计分别在波长306 nm处测定紫外吸光度，绘制RES标准曲线。准确称取一定量喷雾干燥后的RES纳米分散体，充分溶解于DMSO，利用紫外可见分光光度计于306 nm处测定药物吸光度，再计算得到药物的质量浓度。RES纳米分散体的载药量和载药率按照公式(1)、(2) 计算得到。
| $L = \frac{{{m_1}}}{{{m_2}}} \times 100\% $ | (1) |
| $E = \frac{{{m_1}}}{{{m_0}}} \times 100\% $ | (2) |
其中，L为载药量；E为载药率；m0为初始投入RES的总质量；m1为RES纳米分散体中药物的质量；m2为RES纳米分散体的总质量。
1.3.5 体外释药行为表征纳米药物分散体的体外释药行为表征在pH7.4的PBS缓冲介质中进行。称取一定量的纳米药物分散体，置入300 mL PBS缓冲介质中，37 ℃、100 r/min条件下于智能溶出仪中进行测定。设置取样时间点为2 min、5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min。取出5 mL释药溶液后补充5 mL的PBS缓冲介质。利用紫外-可见分光光度计测定介质中药物的浓度，计算得到药物纳米分散体的累积释药量。
2 结果与讨论 2.1 T型微通道反应器操作条件及辅料用量对药物颗粒尺寸的影响图 3是白藜芦醇溶液与反溶剂水溶液在不同进料流量比(QS:QAS=1:5、1:10、1:20、1:30、1:40) 下，T型微通道反应器制备得到的RES纳米分散体平均粒径图。可以看到，当进料比为1:20时，制备所得RES药物颗粒尺寸最小，为205 nm。
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图 3 不同溶剂反溶剂进料比下RES药物颗粒的粒径图 Fig.3 Variation of RES nanodispersion size with different QS/QAS flow ratios |
图 4为固定RES溶液与反溶剂水溶液进料比为1:20时，改变RES溶液和水溶液不同进料量，即QS为1、2、3、4 mL/min，QAS为20、40、60、80 mL/min，T型微通道反应器制备的RES药物颗粒尺寸分布图。当RES溶液进料量为3 mL/min、反溶剂水溶液进料量为60 mL/min时，制备所得RES药物颗粒尺寸最小，为133 nm。
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图 4 不同溶剂反溶剂进料量下RES药物颗粒的粒径图 Fig.4 Variation of RES nanodispersion size with different QS and QAS flow rates |
图 5是固定RES溶液进料量与反溶剂水溶液进料量分别为3 mL/min和60 mL/min时，改变RES溶液与水溶液的不同进料位置，即RES溶液水平进料或垂直进料，T型微通道反应器制备的RES纳米颗粒尺寸图。当RES药物溶液水平进料时，所得RES药物颗粒尺寸最小，为132 nm。
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图 5 不同进料位置RES药物颗粒的粒径图 Fig.5 Variation of RES nanodispersion size with different dispersion phase feed positions |
图 6为RES原料药、PVP、RES纳米分散体的FT-IR谱图。从图中可以看出：3247 cm-1处为RES结构中酚羟基的强吸收峰，1602 cm-1处为顺式—C＝C—的吸收特征峰，965 cm-1处为反式—C＝C—的特征峰。在RES纳米分散体中特征峰强度均有所减弱。
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图 6 RES, PVP, RES纳米分散体的FT-IR谱图 Fig.6 FT-IR spectra of RES, PVP and the RES nanodispersion |
图 7(a)和(b)分别为RES原料药、PVP、RES纳米分散体的XRD和DSC谱图。由图 7(a)可以得到RES原料药为结晶态，RES纳米分散体中并未出现RES原料药的特征衍射峰，表明RES纳米分散体中的RES以无定型形态存在。由图 7(b)可以看出，RES原料药在267 ℃出现明显的吸热熔融峰，而RES纳米分散体中并未出现吸热熔融峰，进一步证明RES以无定型形态均匀分布于PVP中。无定型形态的纳米药物处于亚稳态，使得药物在介质中的饱和溶解度得到提高，进而增加药物的溶出速率。
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图 7 RES, PVP, RES纳米分散体的XRD谱图和DSC谱图 Fig.7 XRD patterns and DSC curves of RES, PVP and the RES nanodispersion |
图 8为RES原料药、RES纳米分散体分别压片后与去离子水接触角的测定图。从图中可以看出，RES原料药压片与去离子水接触角为53°，RES纳米分散体压片与去离子水接触角为19°，表明RES纳米分散体有效地改善了RES原料药的润湿性能，进一步说明RES原料药水溶性得到提高。
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图 8 接触角测定 Fig.8 Contact angle surveys |
根据标准曲线的测定方法，得到RES的标准曲线为ρ=22.7273A+0.0206(R2=0.9999), 其中ρ为药物的质量浓度(μg/mL)，A为药物在306 nm处的紫外可见光谱吸收峰值。结合标准曲线和公式(1)、(2)，计算得到RES纳米分散体载药量和载药率分别为20.5%和82.9%。
RES纳米分散体在pH 7.4的PBS缓冲溶液中的体外释放结果如图 9所示。可以看出，RES原料药在120 min内累积释放率为39%，RES纳米分散体在120 min内累积释放率为95%。表明RES纳米分散体与RES原料药相比，溶出速率和累积释放率均得到大幅度提升，从而证明了将RES制备成纳米分散体能够有效改善RES原料药的水溶性能。
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图 9 pH7.4条件下RES原料药与RES纳米分散体的体外释药曲线 Fig.9 In vitro drug release profiles of the drug and the drug nanodispersion in PBS at pH7.4 |
套管式微通道反应器可以看作多个T型微通道反应器的串、并联结果，实现了T型微通道反应器的放大[11-12]。在T型微通道反应器工艺优化的基础上，本文利用套管式微通道反应器进行了放大。
图 10为套管式微通道反应器制备的RES纳米分散体的粒径分布图。结果表明制备所得RES纳米分散体的平均粒径为82 nm，较上述T型微通道反应器制备所得分散体平均粒径有所减小。
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图 10 纳米药物分散体的粒径分布图 Fig.10 Size distribution of RES nanodispersion obtained using the tube-in-tube microchannel reactor |
套管式微通道反应器制备所得RES纳米分散体在pH7.4的PBS缓冲溶液中的体外释放结果见图 11。图中RES原料药和T型微通道反应器制备所得RES纳米分散体在120 min内累积释放率分别为39%和95%，套管式微通道反应器制备所得RES纳米分散体在120 min内累积释放率为97%，比T型微通道反应器制备所得RES纳米分散体溶出略有提高，这可能与制得的分散体颗粒尺寸更小有关。
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图 11 RES原料药、T型微通道反应器和套管式微通道反应器制得纳米药物分散体在pH7.4的PBS溶液中的体外释药行为 Fig.11 In vitro drug release profiles of the drug, the drug nanodispersion prepared using the T-junction microchannel and using the tube-in-tube microchannel reactor in PBS at pH7.4 |
根据套管式微通道反应器及T型微通道反应器制备RES纳米分散体的操作参数、药物浓度及辅料用量等条件，计算套管式微通道反应器和T型微通道反应器的处理量，具体结果如表 1所示。可以看到，套管式微通道反应器处理量为44.9g/h，约为T型微通道反应器处理量的10倍，处理量有显著提高。
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下载CSV 表 1 T型微通道反应器与套管式微通道反应器处理量的计算结果 Table 1 Throughput of T-junction microchannel and tube-in-tube microchannel reactor |
(1) T型微通道反应器制备RES纳米分散体的优化操作条件为：RES溶液与水溶液进料量比1:20，即RES溶液进料量3 mL/min、水溶液进料量60 mL/min，RES溶液水平进料。此时制备所得RES药物分散体的平均粒径最小，为132 nm。
(2) RES原料药及RES纳米分散体的XRD、DSC测定结果表明，在RES纳米分散体中RES以无定型形态有效均匀地分散在PVP与SDS辅料体系中。RES纳米分散体接触角为19°，RES原料药接触角为53°，表明RES纳米分散体润湿性得到改善。
(3) RES纳米分散体的载药量及载药率分别为20.5%和82.9%。体外溶出实验表明在pH7.4拟肠液介质中，RES纳米分散体在120 min内累积溶出量可达到95%。表明与RES原料药相比，RES纳米分散体的溶出速率和累积释放率均得到大幅度提升。
(4) 在T型微通道制备RES纳米分散体工艺优化的基础上利用套管式微通道反应器进行放大，制备得到RES纳米分散体平均粒径为82 nm，在pH7.4介质中120 min累积释放率可达到97%，较T型微通道反应器制备所得产物溶出性能略有提高。套管式微通道反应器制备RES纳米分散体的处理量约为T型微通道反应器处理量的10倍，显著提高了微通道制备RES纳米分散体的处理量。
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