近年来，聚合物纳米胶束由于具有生物相容性好、可提高药物表观水溶性、减少网状内皮系统(RES)对药物的吞噬、延长体内循环周期、增加药物在肿瘤组织处的定位积累等优点，成为一类极具应用前景的抗癌药物载体[1-2]。聚合物胶束经过特殊修饰基团修饰后，可以在体内特异性地集结于靶部位，携带药物浓集于肿瘤部位，对特定病变部位的环境进行刺激，在结构、物理和化学性质方面做出相应的变化，从而控制药物释放，提高药效，降低毒副作用[3-5]。
体内正常组织与癌细胞周围环境的pH存在明显差异性，大多数癌细胞生存外环境pH为6.5~7.2[6]，然而正常组织生存环境相对比较温和，其pH为7.4[7]。载体携带药物经过内吞作用进入癌细胞后，经历的环境pH会继续降低，例如在核内体pH为5.5~6.0[8-9]，溶酶体pH为4.5~5.0[10]。运用不同组织和细胞间的pH差异，设计制备相应pH响应性的聚合物，能够实现药物的可控释放[11-14]。叶酸是细胞增殖时碱基合成所必需的维生素，在许多肿瘤细胞表面过度表达。叶酸修饰过的治疗药物可以减小体内毒副作用并增强其对肿瘤细胞的毒性，对恶性肿瘤治疗具有实际应用意义[15-17]。由于目前大多数响应性聚合物在体内稳定性较低、生物相容性及降解性较差，限制了其在药物传递领域的应用，因此有必要开发新型的载体材料。
壳聚糖是一种天然存在并带有正电荷的多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，被广泛用作药物载体[18-20]。本文制备叶酸(FA)和胆固醇琥珀酸单酯(CHS)共修饰的羟丙基壳聚糖(HPCHS)，作为叶酸靶向pH响应性胶束用于抗癌药物阿霉素(DOX)的输运，考察了胶束的载药性能及pH响应机理，并研究了胶束的细胞毒性及肿瘤靶向性。
1 实验部分 1.1 实验原料和仪器 1.1.1 实验原料羟丙基壳聚糖，分子量15 kDa，南京绿神有限责任公司；胆固醇琥珀酸单酯，叶酸，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，二环己基碳二亚胺(DCC)，均为分析纯，美国Sigma Aldrich；二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，北京化学试剂公司；阿霉素(DOX)，原料药，北京中硕试剂有限公司；DMEM高糖，MCF-7、HeLa细胞，北京协和基础细胞医学中心。
1.1.2 实验仪器8700型傅里叶红外光谱(FT-IR)仪，美国Nicolet公司；AV Ⅲ 400M核磁共振波谱(1H-NMR)仪，德国Bruker公司；3000HS激光粒度分析仪和zeta电位测定仪，英国Malvern公司；UV-2600紫外分光光度计(UV-Vis)，日本岛津公司；JY92-DN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技有限公司；RCM8D溶出试验仪，天大天发科技有限公司；F-7000荧光分光光度计，日本Hitachi公司。
1.2 制备方法 1.2.1 CHS-HPCHS-FA的合成120 mg羟丙基壳聚糖溶于水，静置10 h确保完全溶解，搅拌下逐滴加入24 mL无水乙醇，随后加入30 mg EDC·HCl及30 mg NHS。继续搅拌活化2 h后逐滴加入CHS的85%乙醇溶液，室温反应72 h后将溶液置于透析袋(截留分子量为8000~14000 Da)中透析，过滤，冻干后得到白色的产物—胆固醇琥珀酸单酯修饰的羟丙基壳聚糖(CHS-HPCHS)。
将2.0 g叶酸溶于40 mL无水DMSO中，加入1.0 g NHS以及1.83 g DCC，搅拌下缓慢滴入1 mL三乙胺，30 ℃下反应10 h，过滤，将滤液减压蒸馏，缓慢加入至冷的无水乙醚中，过滤即得黄色沉淀物叶酸活性酯。
将制得的胆固醇琥珀酸单酯修饰的羟丙基壳聚糖160 mg加入去离子水搅拌使其完全溶解，缓慢加入20 mg/mL叶酸活性酯的DMSO溶液，40 ℃下反应8 h，将反应溶液置于透析袋中，去离子水避光透析72 h。冻干即得叶酸与胆固醇琥珀酸单酯共修饰的羟丙基壳聚糖(CHS-HPCHS-FA)。
1.2.2 胶束的制备称取40 mg 1.2.1节制备的聚合物，加入20 mL去离子水，采用细胞破碎仪超声20 min(功率90 W，工作5 s停歇5 s)，即得聚合物自组装纳米胶束。在5000 r/min的搅拌速度下将1 mL溶有阿霉素的DMSO溶液缓慢滴加至上述所得胶束溶液中，避光搅拌后转移至透析袋中透析20 h即得载药胶束。
1.3 表征方法 1.3.1 临界胶束浓度的测定采用稳态荧光探针法以芘作探针测定两亲性聚合物的临界胶束浓度(CMC)[21-22]。将芘定量溶于丙酮配制成浓度为6×10-6 mol/L的溶液，精确移取1 mL至10 mL的容量瓶中，60 ℃条件下待丙酮挥发后，将配制的质量浓度为0.500, 0.300, 0.200, 0.100, 0.050, 0.025, 0.010和0.005 mg/mL的CHS-HPCHS聚合物胶束加入到容量瓶中，静置24 h。通过荧光分光光度计在室温下测量芘的稳态荧光激发光谱。
1.3.2 载药胶束的载药量和包封率的测定配制阿霉素标准溶液, 采用紫外可见分光光度计测定其在波长479 nm处的吸光度，绘制紫外吸收标准曲线。称取一定量的载阿霉素聚合物胶束，溶解后测定阿霉素的含量，载药量和包封率计算见公式(1)、(2)。
| $ L = \frac{{{m_1}}}{{{m_2}}} \times 100\% $ | (1) |
| $ E = \frac{{{m_1}}}{{{m_0}}} \times 100\% $ | (2) |
其中，L为载药量；E为包封率；m0为初始投入阿霉素的总质量；m1为载药胶束中阿霉素的质量；m2为载药胶束总质量。
1.3.3 胶束的体外溶出实验采用动态透析法将制备的载药胶束溶液加入透析袋中，分别于pH 5.5及pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中在37 ℃、100 r/min恒温水浴下振荡，间隔一定时间取样。利用紫外分光光度法确定药物浓度，根据公式(3) 计算阿霉素的累积释放率。
| $ C = \frac{{{n_1}}}{{{n_0}}} \times 100\% $ | (3) |
其中，C为阿霉素的累积释放率；n1为一定时间释放出的阿霉素的物质的量；n0为初始投入的阿霉素的总物质的量。
1.3.4 胶束细胞毒性的测定采用MTT法[23-24]考察空白胶束及其载药胶束对宫颈癌(HeLa)细胞与乳腺癌(MCF-7) 细胞的细胞毒性。将HeLa和MCF-7细胞接种于DMEM培养基(含有胎牛血清、青链霉素混合液)的96孔板中，培养24 h后分别加入20 μL载药胶束、药物溶液(空白对照组加入等量的PBS缓冲液)，继续培养24 h。之后在孔板中每孔加入20 μL质量浓度为5 mg/mL噻唑蓝的PBS溶液，继续培养4 h。吸去全部培养液，在每个孔板中加入150 μL DMSO，使形成的固体完全溶解于DMSO。采用酶标仪检测570 nm处的吸光度值，以未加样品的培养孔为空白对照组，根据公式(4) 计算细胞存活率。
| $ V = \frac{{{A_1}}}{{{A_0}}} \times 100\% $ | (4) |
其中，V为细胞存活率；A1为实验组的OD值；A0为对照组的OD值。
2 结果与讨论 2.1 CHS-HPCHS-FA的化学结构原料CHS、HPCHS和产物CHS-HPCHS的红外谱图如图 1所示。对比发现，产物CHS-HPCHS在1750 cm-1处出现了特征峰，对应CHS上的羰基，且对比产物与原料CHS红外谱图可看出其余特征峰的强度和位置均不同，说明产物中没有CHS残留。而在1650 cm-1处酰胺键的峰强度有所增加，进一步说明CHS与HPCHS发生反应时形成了酰胺键。
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图 1 原料和产物的红外谱图 Fig.1 FT-IR spectra of reactants and products |
图 2所示CHS-HPCHS的1H-NMR谱图在δ=2.61，2.68出现的峰归属于CHS的—CH2CO—的特征峰，进一步证实CHS已偶联到HPCHS上。
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图 2 CHS-HPCHS的核磁氢谱图 Fig.2 1H-NMR spectrum of CHS-HPCHS |
改变CHS投料量合成两种CHS取代度不同的CHS-HPCHS，采用元素分析法得到CHS取代度结果如表 1所示。
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下载CSV 表 1 CHS-HPCHS中CHS的取代度(DS)分析 Table 1 Analysis of the degree of substitution (DS) of CHS |
选择CHS取代度为6%的聚合物CHS-HPCHS与叶酸进行反应，得到产物为CHS-HPCHS-FA的1H-NMR谱图如图 3所示。图中δ=8.68，7.61，6.79等位移处(图中圆圈标示)出现叶酸的特征峰，说明叶酸成功修饰在CHS-HPCHS上。
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图 3 叶酸靶向、取代度为6%的CHS-HPCHS的核磁氢谱图 Fig.3 1H-NMR spectrum of 6% CHS-HPCHS-FA |
由于叶酸的取代度较低，而其在波长356 nm处有紫外特征吸收峰，因此应用紫外分光光度法确定叶酸的取代度。分析得到在现有制备条件下制得的产物中叶酸的取代度为0.9%。
2.2 胶束的CMC及pH响应行为以激发光谱中波长为338 nm和333 nm处的荧光强度比值对浓度的对数作图，得到产物CHS-HPCHS-1聚合物的CMC值为0.0955 mg/mL，CHS-HPCHS-2聚合物的CMC值为0.0562 mg/mL。两种不同取代度的CHS-HPCHS的临界胶束浓度都很低，表明它们均可以在较低浓度的水相中自组装形成稳定的胶束。相比之下，CHS-HPCHS-2聚合物的临界胶束浓度更低，这是由于疏水片段取代度越高，越容易形成胶束疏水内核，从而在相对较低的浓度下也可以形成稳定的胶束，保持结构完整。采用激光粒度分析仪和zeta电位测定仪考察不同pH条件下两种不同CHS取代度的聚合物胶束粒径及zeta电位变化，结果列于表 2。
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下载CSV 表 2 CHS-HPCHS-1和CHS-HPCHS-2在不同pH条件下的粒径和电位变化 Table 2 Size and zeta potential of CHS-HPCHS-1 and CHS-HPCHS-2 micelles as a function of the change in pH |
从表中可以看出，CHS-HPCHS-1聚合物胶束的粒径大于CHS-HPCHS-2聚合物胶束的粒径，是由于疏水片段增加导致疏水内核结构紧缩而粒径减小。随着pH值降低，两种不同取代度的胶束粒径和zeta电位均增大。这是由于壳聚糖具有氨基，在酸性条件下HPCHS链段发生溶胀，导致胶束结构变得松散，从而粒径增大。pH从7.4变化到4.6，CHS-HPCHS-2胶束粒径从215.7 nm变为438.4 nm，zeta电位从-0.8 mV变为17.7 mV。以上结果表明，CHS-HPCHS胶束具有明显的pH响应性，通过调节体系酸碱度，可以实现对药物的控释。
2.3 胶束的载药性能采用透析法制备载阿霉素胶束，考察了不同投药比时聚合物胶束的载药效果，结果如表 3所示。可以看出，随着投药比的增大，载药量有所增加，包封率则略有降低。在相同投药比的条件下，CHS-HPCHS-2的载药量与包封率均高于CHS-HPCHS-1，这是由于疏水片段取代度越高，越有利于对难溶性药物的增溶，从而更有助于对药物的负载；而CHS-HPCHS-2与CHS-HPCHS-FA相比载药量与包封率基本接近，说明叶酸的引入基本不影响胶束对阿霉素的载药量及包封率。
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下载CSV 表 3 聚合物载阿霉素胶束的表征 Table 3 Characteristics of DOX-loaded polymer micelles |
不同pH条件下载阿霉素胶束体外释放曲线如图 4。可以看出载阿霉素胶束的释药速率与载体本身性质以及pH环境有关。3种不同的聚合物载药胶束在释药初期均不存在突释现象，而且都表现出pH响应释药行为。在pH 5.5条件下胶束的释药更快，速率均约为pH 7.4条件下的1.5倍。结合表 2的分析结果可知，pH 5.5条件下HPCHS链段发生溶胀，胶束结构变得松散，从而加速了药物的释放。
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图 4 pH 5.5和pH 7.4条件下载药胶束中DOX的释药情况 Fig.4 DOX release from drug-loaded micelles at pH 5.5 and pH 7.4 |
同时，对于CHS-HPCHS载药胶束，CHS的取代度越高，释药速率越慢。在pH 5.5的条件下，CHS-HPCHS-1载药胶束在72 h释药66%，而CHS-HPCHS-2载药胶束在72 h只释放了52%的药物。这可能还是由于疏水片段增加导致疏水内核结构更加紧凑，从而阻碍了药物的向外扩散。同时还可以发现，叶酸修饰对载体的释药性能几乎没有影响。
2.5 胶束的细胞毒性CHS-HPCHS-2和CHS-HPCHS-FA胶束对MCF-7、HeLa细胞的细胞毒性如图 5所示。加药24 h后在胶束质量浓度为1000 μg/mL的条件下细胞存活率均在80%左右，表明两种胶束的细胞毒性都较小，生物相容性良好，适合作为药物载体应用于肿瘤的治疗。
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图 5 聚合物胶束的细胞毒性 Fig.5 Cytotoxicity test results for the polymer micelles |
加药24 h后CHS-HPCHS-2和CHS-HPCHS-FA载阿霉素胶束及原料药阿霉素对于MCF-7、HeLa两种细胞的毒性如图 6所示。
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图 6 分别在MCF-7细胞和HeLa细胞中培养24 h后阿霉素载药胶束的细胞毒性 Fig.6 Cytotoxicity of doxorubicin-loaded micelles after 24 h culture in MCF-7 cells and HeLa cells |
对于MCF-7细胞，加药24 h后阿霉素的IC50值(细胞存活率为50%条件下对应的药物的质量浓度)为2.06 μg/mL，CHS-HPCHS-FA载药胶束IC50值为2.40 μg/mL，CHS-HPCHS-2载药胶束IC50值为2.52 μg/mL。对于HeLa细胞，加药24 h后阿霉素的IC50值为1.97 μg/mL，CHS-HPCHS-FA载药胶束IC50值为2.43 μg/mL，CHS-HPCHS-2载药胶束IC50值为2.81 μg/mL。可以看出，与CHS-HPCHS-2载阿霉素胶束相比，CHS-HPCHS-FA载阿霉素胶束的细胞毒性均有明显增加，显示出一定的靶向抗肿瘤效果。
3 结论(1) 成功制备了同时具有叶酸靶向和pH响应的壳聚糖衍生物，该聚合物可以在较低浓度下自组装形成稳定胶束，胶束粒径在200~400 nm。
(2) 聚合物中疏水片段的增加有助于提高阿霉素的负载量；体外释药行为表明，pH 5.5的条件下阿霉素的释药速率约为pH 7.4条件下的1.5倍。
(3) 聚合物胶束具有良好的生物相容性，经叶酸修饰的载药胶束可增强肿瘤细胞的摄取，细胞毒性明显增强，表现出一定的靶向抗肿瘤效果，有望成为具有良好应用前景的靶向抗肿瘤药物载体。
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